海洋几丁质降解菌的筛选、酶的分离纯化及酶学性质研究

论文摘要

几丁质是仅次于纤维素的第二大可再生资源,也是海洋中含量最丰富的多糖。几丁质酶可催化水解几丁质,其降解产物几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖具有抗菌、抗肿瘤、增强机体免疫功能等活性,在食品、医药、化妆品、预防植物病虫害等方面有重要应用价值。利用几丁质酶水解几丁质制备几丁寡糖近年来引起人们广泛关注。由于从多种陆地微生物中分离出的几丁质酶活力普遍不高,而海洋中由于积聚有较多的几丁质,因此能利用它的微生物也较多,成为人们筛选的主要目标。鉴于海洋微生物具有突出的耐压、耐碱、耐盐、耐冷等特点,因此从海洋微生物中提取几丁质酶具有十分重要的意义。本研究以从广西北海海域采集到的样品为材料,利用几丁质平板透明圈法对产几丁质酶的海洋微生物进行初筛,获得了52株产酶菌株。再利用DNS法对透明圈较大的10株进行发酵测酶活力复筛,最终选择了一株从贝壳表面分离的菌株（编号Y1）进行实验,该菌株产酶能力大且产酶能力稳定。通过对菌株Y1的16SrDNA序列的测定,鉴定其为粘质沙雷氏菌属。研究了氮源、胶体几丁质浓度、胰蛋白胨浓度、NaCl浓度、装液量、初始pH值以及接种量和种龄等因素对菌株发酵产酶的影响。确定了该菌株产几丁质酶的最佳条件为:胶体几丁质0.8%,胰蛋白胨0.5%,氯化钠1.5%,250 ml三角瓶装液100 ml,发酵液初始pH值6.0,接种量8%,种龄24小时,培养温度为30℃,150 r/min摇瓶培养。通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析对所收集到的发酵液上清中的几丁质酶粗品进行了分离纯化。纯化产物经SDS-PAGE电泳检测为一条带,其分子量为60 KDa左右。对几质酶的部分酶学性质进行探讨,考察了温度、pH值、金属离子以及底物浓度对该酶活性的影响。发现该酶的最适反应温度为45℃,在35℃条件下较稳定,最适pH值为8.5,且在此pH值条件下最稳定,Ba2+对酶活力有明显的促进作用,最适底物浓度为0.5%。最适条件下,酶的比活力为6.28 U/mg蛋白。对该酶的酶解产物进行了硅胶薄层层析鉴定,NAG4（含4个葡萄糖单元的氨基寡糖）为酶解反应的主要产物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 海洋微生物几丁质酶的来源和分类
• 1.2 海洋微生物几丁质酶的性质研究
• 1.3 海洋微生物几丁质酶的催化机制
• 1.4 几丁质酶基因的分子生物学研究
• 1.5 几丁质酶在转化海洋废物方面的研究
• 1.6 展望
• 1.7 本课题的研究意义
• 2 产几丁质酶海洋菌株的分离与鉴定
• 2.1 材料及试剂
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 3 产几丁质酶细菌发酵条件的优化
• 3.1 材料及试剂
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 4 几丁质酶的纯化及性质研究
• 4.1 材料及试剂
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
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