树突状细胞与CRP在动脉粥样硬化发生发展中的关系及机制研究

论文摘要

背景/意义冠心病（coronary heart disease,CHD）是目前威胁全人类健康和生命的主要疾病之一,由于其发病机制尚不明确,成为诊断和治疗的重大障碍。针对其发病机制的研究,不仅一直是众多学者研究的热点,而且有利于降低CHD的发病率和死亡率。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是CHD的病理改变基础。AS的发病机制复杂,其发展过程主要经历脂纹、脂斑、纤维斑块、粥样硬化斑块等逐渐进展时期,具有缓慢进展的特点,但AS的发病机制仍未十分明确。近年来,炎症免疫反应在动脉粥样硬化发生发展中的作用日益受到关注,其理论的核心是:在动脉粥样硬化的危险因素等抗原的刺激下,激活T淋巴细胞,引起的一系列特异性细胞免疫及体液免疫反应,进一步激活效应细胞,如巨噬细胞、血小板和平滑肌细胞,从而导致炎性产物的剧烈增加,促进动脉粥样硬化发生发展和斑块的破裂。最近几年研究发现,在体内具有最重要的抗原提呈和免疫应答调节的树突状细胞（dendritic cells,DCs）在动脉粥样硬化斑块形成、发展中的作用受到广泛关注。最近的研究提出,DCs在动脉粥样硬化的早期和晚期都有数量和功能的改变,尤其是DCs可能与冠心病晚期急剧进展有关。C反应蛋白（C reaetiveProtein,CRP）是当前备受关注的动脉粥样硬化炎症标志物之一,在预测AS导致的各种心脑血管事件中具有重要的价值。近年来,较多的体外研究证据表明CRP损伤血管平滑肌细胞,血管内皮细胞,在动脉粥样硬化的发生、发展过程中起着直接/间接的作用,以CRP作为治疗靶点已经成为研究的热点。目前国内外关于CRP与DCs的关系尚未明确报道。针对国内外的研究现状,我们提出以下问题:1.DCs的分型和功能与动脉粥样硬化的发生发展有密切关系,但是与AS的斑块稳定性的关系,尚无明确报道。2.CRP在促进AS的发生发展中扮演重要的角色,但是,CRP与DCs是否存在密切关系,还需要进一步的流行病学调查。3.CRP是否是DCs功能发生改变的因素之一,CRP诱导DCs改变的可能机制是什么?鉴于DCs和CRP在动脉粥样硬化发生发展的重要作用,本课题在以往研究的基础上,首先采用临床病例对照研究,利用流式细胞等技术对不同的冠心病患者的外周血树突状细胞的分型和功能进行检测,利用血管内超声检测冠状动脉斑块的性质,试图说明DCs与动脉粥样硬化斑块稳定系的关系,以及利用多种分子生物学技术从细胞水平上探讨CRP与DCs的关系及其相关机制。本课题的研究结果将为指导临床上诊断不稳定心绞痛提供了新的标志物,并且为明确CRP和DCs在动脉粥样硬化中的关系提供了可靠的实验室资料,为阐明AS的发病机制提供了一条新的方向。全文主要分2个部分来阐明。方法和内容第一部分不同冠心病患者外周血树突状细胞分型及功能检测目的:本研究根据患者临床情况、冠脉造影和血管内超声（intravascularultra-sound,IVUS）诊断冠心病和斑块的稳定性,研究不同类型和不同性质斑块冠心病患者外周循环中DCs数量和功能的变化,探讨DCs与冠脉粥样硬化斑块从稳定到到“易损”的关系,以期早期发现易损斑块,指导临床诊治。方法:入选病例总共80例,其中AMI组15例、UAP（CTNI+）组15例、UAP（CTNI-）组15例、SAP组17例、CTL18例,一般临床资料的比较显示:各组的年龄、性别比例相比差异无显著性意义（P＞0.05）。各组中主要的心血管病危险因素,如:吸烟（Smoking）、高血压（Hypertension）、血糖（Diabetes mellitus）、总胆固醇（Total cholesterol）、甘油三脂（Triglyceride）、高密度脂蛋白胆固醇（HDLcholesterol）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL cholesterol）等,相互之间的比较差异无显著性意义（p＞0.05）,将冠心病按稳定心绞痛、肌钙蛋白阴性不稳定心绞痛（不存在着心肌坏死）、肌钙蛋白阳性不稳定心绞痛（心肌坏死标记物轻度升高,存在着少量心肌细胞坏死）、急性心肌梗死分型,能较好的反应冠脉粥样斑块从稳定-炎症反应增强-斑块破裂-微小血栓形成-大血栓形成-相关血管闭塞的病理生理过程,即斑块从稳定到易损的过程。SAP、UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）组各10例患者行IVUS检查,根据IVUS表现分为破裂斑块组（7例）、不稳定斑块组（12例）和稳定斑块组（11例）;流式细胞4色分析法检测DCs亚型前提的比例;流式细胞仪、酶联免疫吸附试验（ELISA）等分子生物技术测定DCs功能。结果:1.外周血mDC1s、mDC2s和pDC亚群根据细胞膜表达的CD1C和CD141、CD303阳性用流式细胞术来确定。A.相比正常对照人群,1)SAP患者外周血DCs、mDCs、mDC1s、pDCs占外周血白细胞的比例和数量无显著变化;2)UAP（CTNI-）患者DCs、mDCs、mDC1s比例和数量增高,mDC2s数量增多,pDCs的比例增高;3)AMI患者DCs、mDCs、mDC1s、pDCs占外周血的比例和数量均减少,mDC2s的数量下降;4)UAP（CTNI+）患者DCs、mDCs、mDC1s比例降低,数量无显著改变,mDC2s数量增多,pDCs的比例和数量均未见显著改变。B.与UAP（CTNI-）组相比,AMI患者DCs、mDCs、mDC1s、pDCs的占外周白细胞比例和数量显著下降,mDC2s数量减少;UAP（CTNI+）患者的DCs、mDCs、mDC1s的比例显著降低,mDC2s数量下降,pDCs未见改变;C.相比UAP（CTNI+）组,AMI组患者DCs、mDCs、mDC1s、pDCs的占外周白细胞比例和数量显著下降,mDC2s数量减少。2.SAP、UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）组各10例忠者行IVUS检查,根据IVUS表现检出为破裂斑块7例、不稳定斑块12例和稳定斑块11例。其中SAP组患者8例为稳定斑块、2例不稳定斑块,UAP（CTNI-）组不稳定斑块7例,稳定斑块2例,破裂斑块1例,UAP（CTNI+）组破裂斑块6例,不稳定斑块3例,稳定斑块1例,能较好地反应分组的思路:即SAP-UAP（CTNI-）-UAP（CTNI+）大致体现冠状动脉斑块从稳定-炎症反应增强-斑块破裂、微小血栓形成的病理生理过程。不稳定斑块组DCs、mDCs、mDC1s的占外周血白细胞比例及绝对数均比稳定斑块组显著增多,mDC2s、pDCs比例、数量未见改变;破裂斑块组患者的DCs、mDCs、mDC1s、pDCs比例及绝对数均显著减少,mDC2s比例数量无显著变化。提示外周血DCs数量、比例反应斑块性质,DCs与斑块的的稳定性有关。3.通过成功培养冠心病患者PBMC源性DCs后,测定了不同类型冠心病患者DCs功能,结果如下:1)培养第7天,UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）、AMI组DCs CD86表达（35.61±2.82%、45.57±3.04%、45.25±3.63%）高于CTL、SAP组（19.56±2.82%、20.50±2.64%）,SAP、CTL组无差异,UAP（CTNI+）、AMI组显著高于UAP（CTNI-）组（P＜0.01）,AMI组的表达较UAP（CTNI+）组有升高趋势,但未见统计学意义。2.)培养第7天,在DCs数量为2×105个/ml时,UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）、AMI组DCs刺激T细胞增殖的能力显著高于CTL、SAP组,A值分别为1.66±0.30、2.26±0.42、2.39±0.36和0.70±0.19,0.82±0.22（p＜0.01）,SAP、CTL组无差异;UAP（CTNI+）、AMI组显著高于UAP（CTNI-）组（p＜0.01）,AMI组的表达较UAP（CTNI+）组有升高趋势。3)混合淋巴细胞反应上清液中IL-12、IFN-α测定:UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）、AMI组DCs刺激T细胞分泌IFN-α能力显著高于CTL、SAP组,分别为9.57±1.98、13.91±2.27、14.62±3.37和6.466±1.15、6.13±1.43,（P＜0.01）,SAP、CTL组无差异;UAP（CTNI+）、AMI组显著高于UAP（CTNI-）组（P＜0.01）,AMI组强于UAP（CTNI+）组（P＜0.05）;UAP（CTNI-）、UAP（CTNI+）、AMI组DCs分泌IL-12强于CTL、SAP组,分别为:3.59±0.66、3.64±0.62、6.10±1.17、8.17±1.47和9.31±2.55,UAP（CTNI+）、AMI组显著高于UAP（CTNI-）组（P＜0.01）,AMI组的表达较UAP（CTNI+）组有升高趋势。4.应用ELISA技术检测不同分型冠心病患者血浆前炎症因子hs-CRP和IL-6的浓度:相比对照组血清hs-CRP（2.63±0.57）,UAP（CTNI-）（4.12±0.88p<0.01）、UAP（CTNI+）组（8.59±1.64,p<0.01）和AMI组（13.96±2.21,p<0.01）显著升高,SAP组无变化,UAP（CTNI+）、AMI组高于UAP（CTNI-）组,AMI组高于UAP（CTNI+）组（p<0.05）;比较各组IL-6水平,相比CTL组及SAP组,UAP（CTNI+）、AMI显升高,且AMI组高于UAP（CTNI+）组（p<0.01）,提示不稳定冠心病患者血浆前炎症因子水平升高,AS的进展与前炎症细胞因子的分泌高度相关。5.进一步分析发现,血浆hs-CRP和IL-6的水平与DCsCD86表达及刺激淋巴细胞增殖能力成正相关,r值分别为:0.80,0.89（hs-CRPp<0.01）,0.59,0.57（IL-6,p<0.01）。结论:1.冠心病不同阶段,外周血DCs数量和比例的改变不同。在斑块从不稳定到“易损”的进展中,数量、比例从经历了正常-显著升高-减少的过程。2.本研究分组SAP-UAP（CTNI-）-UAP（CTNI+）可大致体现冠状动脉斑块从稳定-炎症反应增强-斑块破裂的病理生理过程。不稳定斑块组mDCss的占外周血白细胞比例及绝对数均比稳定斑块组显著增多;破裂斑块组患者的mDCs、pDCs比例及绝对数均显著减少,mDC2s比例、数量无显著变化。提示外周血DCs数量、比例反应斑块性质,DCs与斑块的稳定性有关。3.在冠状动脉斑块的稳定性改变过程中,DCsCD86表型不断增高,刺激淋巴细胞增殖能力增强,炎症因子INF-a、IL-12分泌增加。4.不同阶段冠心病患者PBMC源性DCsCD86表达、刺激淋巴细胞增殖能力与血浆hs-CRP和IL-6水平成正相关。因此,冠心病患者外周血DCs数量、功能变化提现斑块的稳定性变化,在不存在造血功能异常的条件下,检测冠心病外周血DCs数量、比例及功能可以一定程度反应冠心病患者冠脉斑块稳定性,可用于指导冠心病的分型及判别斑块性质。第二部分CRP对树突状细胞分化成熟及机制研究目的:CRP对DCs分化过程中功能的影响,从而探讨DCs和CRP的关系以及相关机制。方法:分离人外周血单个核细胞,在含重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF,100ng/ml）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4,20ng/ml）的完全培养基中培养;根据不同的实验目的进行分组,主要分成3个实验目的。目的1:观察不同浓度CRP对DC细胞功能的影响;分成3组:①对照组;②CRP组:分别在细胞培养基中分别加入浓度为0.6、2、6、20和60μg/mL的CRP;③LPS组:加入含（0.1μg/mL）LPS的100μl,使终浓度为1 mg/L;目的2:观察不同干预因素对DCs细胞功能的影响;主要分成①对照组;②CRP组:分别在细胞培养基中分别加入浓度为20和60μg/mL的CRP;③CRP+CD32组（20μg/mL）:预先加入含有CD32 20μg/mL的PBS溶液100μl,6小时加入60μg/mL的CRP,共同孵育24小时。目的3:观察不同浓度CRP和不同干预因素对DCs表达CCR7的影响。①对照组;②CRP组:分别在细胞培养基中分别加入浓度为20μg/mL和60μg/mL的CRP;③CRP+CD32组（μg/mL）:预先加入含有CD32 20μg/mL的PBS溶液100μl,6小时加入60μg/mL的CRP,共同孵育24小时。④预先加入抗CD32特异的抗体6小时,检测DCs中CCR7的含量。主要采用流式细胞术检测DCs中CD1a、CD83、CD86、HLA-DR、CCR7表型;以DCs为刺激细胞、刺激同种异体T淋巴细胞为反应细胞按比例混合后,以混合淋巴细胞反应强度观察对DCs抗原递呈和淋巴细胞增殖的影响;ELISA法检测细胞培养上清细胞因子浓度;RT-PCR和蛋白电泳分别检测DCs中CCR7的表达。结果:光镜下观察各组细胞呈半悬浮样生长,突起明显,胞体变大,形态不规则,大小10-20mm;与未imDC组相比,mDC特征性标志CD1a、DC成熟度标志CD83表达增加,60μg/mL的CRP处理imDC,CD1a和CD83表达无明显变化,但相同处理的mDC组的CDla和CD83表达显著升高（p＜0.05）,mDC表面协同刺激分子CD86、CD40、CD80和CCR7表达分别为（67±4）%、（33±12）%、（45±3）%和（10±3）%,与对照组表面抗原相比,各组表达量均有明显升高;在培养至成熟的DC细胞中分别加入不通剂量的CRP,共同孵育24h后,与对照组相比,0.6ug/ml的CRP对DC表达CD40、CD80:未见明显差异,当剂量增加到2、6、20和60 ug/ml时,CD40和CD80表达量均有明显升高,其中20和60ug/ml的CRP对DCs中表达CD40和CD80的影响高于LPS组,说明CRP可诱导DCs中CD40和CD80的进一步分泌,并且这种作用与LPS诱导CD40和CD80的效果相一致,甚至还高于LPS组。收集经过60μg/mL的CRP处理后8天的DC,少量的细胞就可激发强烈的同种异体T淋巴细胞的增殖反应（p<0.01）,并且随着细胞数的增多,促增殖作用增强;60μg/mL CRP处理的DC刺激T细胞增殖作用显著增强（156.2±11.4,p<0.01）,预先加入了CD32组后再加入CRP的处理组中,T细胞增殖作用进一步增高（p<0.01）,单独应用CD32处理的DC,T细胞未见明显增殖,而应用antiCD32预先孵育6h后的DCs,T细胞未见明显增殖（p>0.05）。ELISA细胞因子定量检测表明,60μg/mL的CRP干预后的DC分泌细胞因子IL-10、IL-12、IFN-λ和IL-2明显高于对照组（p<0.05）,将CRP与CD32共同孵育后,IL-10和IL-12的表达与单独CRP处理组未见明显升高,但IFN-λ和IL-2的表达进一步升高,应用特异的antiCD32抗体预先孵育后,各种细胞因子显著降低,与CRP及CRP+CD32组相比均有统计学意义,单独CD32处理组的DC细胞分泌各组细胞因子无明显改变（P>0.05）。RT-PCR结果显示:用不同浓度的CRP（0.6、2、6、20、60）μg/mL作用24h,DC表达CCR7 mRNA呈浓度依赖关系。CRP浓度为0.6μg/mL时,DC表达的CCR7 mRNA开始高于对照组（p<0.05）,随着浓度的增加达到2、6、20和60μg/mL时,DC表达CCR7增加更显著（p<0.01）,分别是对照组的1.6倍、2.0倍、2.9倍、3.16倍4.17倍,呈明显的剂量依赖性,不同处理因素处理后（对照组、CRP组（20和60μl）、CRP+CD32组、CD32组,CRP+CD32+antiCD32组）,CRP组和CRP+CD32组与对照组相比,CCR7表达显著增加（p<0.01）,分别是对照组的4.1倍和4.7倍,其他两组与对照组相比均无显著差异。CRP组与CD32组相比,CCR7mRNA表达显著增加（p<0.01）,CRP+CD32组与CRP组相比,CCR7mRNA表达有升高趋势,但无统计学差异（p>0.05）,但预先加入antiCD32组,CCR7mRNA表达较CRP组、CRP+CD32组明显降低（p<0.01）;对照组和单独CD32处理组相比,成熟的DC表达CCR7mRNA的含量无明显改变（p>0.05）,见4-8C和D。蛋白电泳结果显示,用不同浓度的CRP（0.6、2、6、20、60）μg/mL作用24h,DC表达CCR7蛋白含量不同。在CRP浓度分别为0.6、2和6μg/mL时,CCR7浓度增加不明显,未呈明显浓度依赖性升高,但仍表现出一定的升高趋势,当浓度达到20和60μg/mL时,CCR7蛋白表达浓度显著增加（p<0.05）,分别是对照组的2.8倍和3.5倍。不同因素作用24h后,DC表达CCR7蛋白的含量也不相同,与对照组相比,20和60μg/mL CRP诱导后的DC表达CCR7蛋白表达显著增加（p<0.05）,单独CD32诱导后的CCR7表达与对照组无显著增加,但与CRP共同孵育的DC表达CCR7有明显升高（p<0.05）,与单独60μg/mL CRP作用相比,虽然未见明显增高,但有一定的升高趋势,采用特异的CD32抗体（antiCD32）预先作用6h后,与对照相比,DC表达CCR7无显著增加（p<0.05）,这与CCR7mRNA的表达结果基本相一致。结论:CRP具有促进人单核细胞来源的DC表型改变的作用,一定浓度的CRP可促进DC表型改变,并有一定的剂量依赖性;CRP通过DC表型改变,引起各种炎症因子的分泌和表达增强;CRP的这种作用与CD32的表达有关,CRP诱导DC表达CCR7是与通过CD32相结合来发挥的,这可能是CRP诱导DC加促动脉粥样硬化进展的机制之一。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 不同冠心病患者外周血树突状细胞分型及功能检测
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 参考文献
• 第二部分 CRP对人单核细胞诱导的树突状细胞分化成熟和免疫功能的影响及其机制研究
• 一 实验材料
• 二 实验方法
• 三 统计学分析
• 四 结果
• 五 讨论
• 参考文献
• 英文缩写词表
• 文献综述
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 统计学证明