论文摘要
目的:通过山苍子油对申克孢子丝菌的体外抑菌试验和体内动物实验,探讨山苍子油体外抗申克孢子丝菌的活性以及评价其灌胃治疗实验性小鼠皮肤孢子丝菌感染的疗效,从而为山苍子油的临床应用提供实验依据。此外,通过电镜观察山苍子油作用前后申克孢子丝菌超微结构的改变,了解其抗菌作用机理。方法:1体外药敏试验1.1纸片扩散法采用纸片扩散法对山苍子油体外抗申克孢子丝菌（包括我科临床分离的皮肤固定型株和皮肤淋巴管型株各7株）的活性进行定性初筛。1.2微量液基稀释法根据美国国家临床试验标准化委员会（NCCLS）发布的M27-A方案,分别检测山苍子油对皮肤固定型株和皮肤淋巴管型株孢子丝菌的最低抑菌浓度（MIC）,并以氟康唑作为质控药物。2体内动物实验2.1小鼠皮肤感染申克孢子丝菌模型的制备将我科保存的皮肤固定型和皮肤淋巴管型申克孢子丝菌菌种（各1株）复温,转种在沙堡氏培养基上,27℃培养10d,用无菌生理盐水制备成菌悬液（1×108cfu/ml）,通过皮下接种免疫抑制小鼠,分别建立固定型株和淋巴管型株申克孢子丝菌感染小鼠皮肤的动物模型。2.2动物模型的检测接种菌悬液4周后,通过小鼠皮损组织逆培养及组织病理切片等方法检测小鼠皮肤孢子丝菌病造模是否成功。2.3药物治疗将皮肤固定型株及皮肤淋巴管型株感染的小鼠分别随机分为山苍子油治疗组、10%KI治疗组及生理盐水治疗组（空白对照组）,以下简称山苍子油固定组、KI固定组、空白固定组、山苍子油淋巴管组、KI淋巴管组及空白淋巴管组。其中山苍子油灌胃量为83.53mg/kg,10%KI灌胃量为18ml/kg,生理盐水灌胃量为0.2ml/次,均为1天1次,连续4周,治疗之日起每日观察小鼠皮损的变化情况。3电镜观察将MIC浓度的山苍子油作用于申克孢子丝菌菌落,24 h后固定,另取未经药物作用的菌落作对照,常规制片后分别行扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察。结果:1纸片扩散法观察1周后可见清晰的抑菌环,10%山苍子油抑菌环直径为16mm,5%山苍子油抑菌环直径为9mm,且观察2周后抑菌环直径有轻微增加。2微量液基稀释法质控药氟康唑对申克孢子丝菌的MIC范围为12ug/ml。山苍子油分别对皮肤固定型株和皮肤淋巴管型株的MIC值经t检验,P>0.05,差异无显著性,两者MIC范围均为156.251250ug/mL。将MIC值范围的生长孔内的菌液转种,未见真菌生长。3动物模型制备皮下接种菌悬液约2周后,接种处开始出现皮损生长,第4周左右皮损生长达高峰。病理模型组10只感染的小鼠经皮损组织逆培养、组织病理学检查等方法测定,小鼠皮肤感染申克孢子丝菌成功,其感染率为90%。4药物治疗山苍子油和10%KI灌胃治疗的前两周小鼠皮损未见明显变化,第3周皮损开始缩小,第4周大部分皮损消退,且治疗过程中未见小鼠出现明显不良反应,空白对照组部分小鼠皮损出现扩散,也有小部分皮损自行消退。以治疗前后皮损直径缩小值为指标进行统计学分析,山苍子油固定组及山苍子油淋巴管组分别与其空白对照组比较均有显著性差异（P<0.05）;山苍子油固定组与KI固定组比较、山苍子油淋巴管组与KI淋巴管组比较均无显著性差异（P>0.05）;此外,山苍子油固定组与山苍子油淋巴管组比较、KI固定组与KI淋巴管组比较也均无显著性差异（P>0.05）。5电镜结果5.1扫描电镜:未经药物作用的菌丝饱满,粗细均匀,孢子完整饱满。经山苍子油作用24h后的菌丝表面粗糙、皱缩、断裂,孢子壁疏松、碎裂。5.2透射电镜:未经药物作用的菌细胞呈规则圆形、椭圆形,细胞结构清晰、层次清楚;细胞壁、细胞膜完整,且厚薄均匀;胞浆丰富均匀;细胞器及细胞核结构完整。经山苍子油作用24h后的菌细胞呈不规则形;细胞膜、细胞壁结构模糊,且厚薄不均;胞浆皱缩,出现多数斑片状电子薄区;细胞器及细胞核结构模糊。结论:1山苍子油体外具有抗申克孢子丝菌的活性,且对固定株和淋巴管株具有相似的抗菌作用,其抗菌活性可能呈杀菌性。2山苍子油灌胃治疗对小鼠皮肤孢子丝菌病具有一定的疗效,且对固定株和淋巴管株感染小鼠的疗效无明显差异。3山苍子油可能通过破坏真菌细胞壁或细胞膜,使细胞内容物大量外渗,扰乱细胞的正常代谢,从而起到了抗真菌作用。