核因子κB在未分化甲状腺癌化疗耐药机制和治疗中的作用

论文摘要

核因子κB（NF-κB）在癌细胞生长、增殖以及化疗耐药性的发生过程中起了重要作用，以DHMEQ为代表的NF-κB抑制剂通过对NF-κB的抑制而诱导癌细胞凋亡，并可以增加肿瘤对化疗的敏感性。截止到2008年10月，从Medline的数据库中没有检索到针对甲状腺癌联合应用NF-κB抑制剂和紫杉烷进行体外、体内实验的文献报道。目的：提出并建立未分化甲状腺癌（ATC）化疗耐药机制的NF-κB诱导理论，并运用体外和体内实验来证实根据该原理将分子靶向性强的NF-κB抑制剂与紫杉烷类化疗药物进行联合的增敏效果和可行性。方法：应用细胞存活分析法研究单独或联合使用不同浓度紫杉醇、多烯紫杉醇和DHMEQ后ATC细胞（FRO和ARO两个细胞系）的凋亡情况，并进一步确定细胞学水平实验中所采用的各自药物浓度。通过DNA结合实验分析药物作用后核内NF-κB与其特异的双链寡聚核苷酸探针的结合能力的变化情况；应用Western blot鉴定药物作用后ATC细胞NF-κB核蛋白表达的变化。应用Western blot鉴定药物作用后ATC细胞内凋亡关键因子（PARP、caspase 3、XIAP和survivin）蛋白表达的变化。采用Annexin V-FITC／PI双标记染色及流式细胞仪技术进一步鉴定药物作用后ATC细胞的凋亡变化。在动物实验中首先进行了确定多烯紫杉醇剂量的两组预实验，在正式的体内实验中将裸鼠随机分为4组（多烯紫杉醇组、DHMEQ组、联合用药组和对照组），使用预实验中确定的药物剂量进行腹腔内（i．p．）注射，动物实验的整个观察周期为32天；在停药后的第一天从不同治疗方案的四组中各任意选取一只裸鼠处死、取下瘤体做TUNEL凋亡染色和凋亡指数的计算。结果：①ATC细胞的存活分析显示存活细胞数目和药物的浓度均呈反比，药物联合应用比单一用药更有效、存活细胞数显著减少（统计结果有显著性差异），且FRO比ARO对药物更敏感些。此外，确定了细胞学水平实验中采用的紫杉烷和DHMEQ浓度分别为4nM和10μg／ml。②DNA结合实验显示单用多烯紫杉醇时结合能力随时间逐渐增强，DHMEQ联合多烯紫杉醇时结合能力明显受到抑制（统计结果有显著性差异），尤其是前8个小时。对紫杉烷作用4小时后的核蛋白进行Westernblot，显示NF-κB浓度增高，而DHMEQ抑制NF-κB向核内的转运，会使其核蛋白浓度降低，联合用药时仍可以抑制紫杉烷导致NF-κB的升高。③Western blot显示紫杉烷作用24小时后总蛋白中的关键凋亡因子capsase 3的活化水解产物、PARP的失活裂解产物明显增多，DHMEQ亦可使二者的水解产物升高，但联合用药时二者升高得更为显著；24小时时程的变化显示细胞总蛋白capsase 3的活化水解产物、PARP的失活裂解产物逐渐升高，且DHMEQ诱导凋亡的作用更为迅速，在很早的时程内就可使二者大量出现。此外，ATC细胞对凋亡拮抗因子XIAP和survivin的基础表达就比较明显，紫杉烷作用24小时后这两者表达水平均升高，但DHMEQ可使XIAP和survivin明显降低，联合用药时仍然是减低的，说明DHMEQ可以有效地抑制ATC细胞本身固有的和由于NF-κB增高而诱导进一步增高的凋亡拮抗因子。④流式细胞仪的结果显示虽然单独使用多烯紫杉醇和DHMEQ都会诱导凋亡产生，但是联合用药后被Annexin V和PI阳性标记的细胞显著升高。⑤动物预实验确定了多烯紫杉醇使用的剂量为5 mg／kg（第5和12天i．p．注射），DHMEQ使用剂量为6mg/kg/day（第5-18天i．p．注射），联合用药组两药和用、剂量同上，对照组i．p．注射1：1体积比的DMSO和PBS；体内实验观察结果显示虽然单独使用药物可以抑制移植瘤体的生长，但是联合用药能获得更显著的抑制效果（统计结果有显著性差异）；TUNEL凋亡染色和凋亡指数亦显示联合用药比单独用药能更显著地增加凋亡染色阳性细胞的数目（统计结果有显著性差异）。结论：1．本研究证实紫杉烷类药物会诱导ATC细胞NF-κB的增高、从而削弱紫杉烷的疗效（即存在着NF-κB诱导机制），而NF-κB抑制剂DHMEQ可以有效地抑制这种现象。2．在细胞学的水平上证明虽然单独使用紫杉烷和DHMEQ均可以抑制ATC细胞的增殖，但联合用药时对凋亡的诱导有协同效应。3．进行了应用多烯紫杉醇治疗ATC的体内实验，并在裸鼠体内首次尝试NF-κB抑制剂和多烯紫杉醇联合治疗ATC肿瘤，结果证实联合用药可以更有效地抑制瘤体的增长、有协同效应。4．上述体外和体内实验证明：在ATC细胞化疗耐药产生过程中存在着NF-κB诱导机制。根据该原理将分子靶向性强的NF-κB抑制剂DHMEQ与紫杉烷类化疗药物进行联合可以通过抑制NF-κB降低癌细胞对抗凋亡的阈值，因此，在联合治疗时不仅可以增加癌细胞对化疗药物的敏感性、降低化疗药物的使用剂量，也可以获得协同的疗效。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明和英文缩略语注释
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 第一部分 NF-κB抑制剂与紫杉烷联合应用于未分化甲状腺癌的体外研究
• 对象和方法
• 结果
• 第二部分 NF-κB抑制剂与紫杉烷联合应用于未分化甲状腺癌的体内研究
• 对象与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 NF-κB抑制剂和紫杉烷在肿瘤治疗中的应用
• 参考文献
• 致谢