反硝化菌DNF409中硝酸盐还原酶基因敲除的研究

论文摘要

养殖水环境的日趋恶化已成为制约我国水产养殖业发展的重要因素,而对于养殖业来说,亚硝酸盐的的积累所造成的危害更甚,严重制约了水产经济的发展。生物反硝化法是理论上解决水体氮污染的有效方法。本课题是以本实验室分离到的一株腊样芽胞杆菌DNF409为原始出发菌株,该菌株具有极强的反硝化能力,能在72h内将硝酸盐污染水体中的硝酸盐,从40μg/mL的浓度降为5μg/mL以下。但在污水处理过程中存在着亚硝酸盐严重积累的现象。课题目的是将该菌株中硝酸还原酶基因,通过分子生物学手段将其敲除,成为专一降解亚硝酸盐菌株。具体研究结果如下:（1）利用E.coli与Bacillus sp.的穿梭质粒Pdg646,构建了基因敲除载体pDGLSR-Ts,它携带有两个长度分别为1 kb、920bp且与narGHIJ基因序列方向完全相同的同源臂Larm和R arm,然后在两段同源臂之间利用酶切插入可在菌株DNF409中表达的抗性片段Smr/Spcr,同时载体部分含有可在菌株中DNF409表达的抗性标记kanr,且带有一个温度敏感型的复制子,便于重组子的筛选。（2）将narG基因中断载体pDGLSR-Ts电激转化至反硝化菌DNF409中,经过抗性筛选得到表型为SmrKans的narGHIJ部分基因敲除双交换菌株,并通过PCR分析证实narGHIJ部分基因已经在正确位置通过双交换实现敲除。（3）双交换敲除菌株接入富含硝酸盐及亚硝酸盐的模拟污水中进行反硝化作用实验,发现ZL150硝酸盐的还原能力相比DNF409下降了70%,但发现其对亚硝酸盐的还原能力同时也降低了50%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略名词表（ABBREVIATIONS）
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 生物脱氮的原理
• 1.2.1 传统生物脱氮的基本原理
• 1.2.2 新型生物脱氮理论
• 1.3 反硝化细菌概述
• 1.4 反硝化酶系
• 1.4.1 硝酸盐还原酶（Nar）
• 1.4.2 亚硝酸盐还原酶（Nir）
• 1.4.3 一氧化氮还原酶（Nor）
• 1.4.4 一氧化二氮还原酶（Nos）
• 1.5 反硝化细菌DNF409特性
• 1.5.1 反硝化细菌DNF409菌种特性
• 1.5.2 反硝化细菌DNF409的反硝化特性
• 1.6 基因敲除的原理
• 1.7 研究的内容和目的
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 重组质粒pDGLSR-Ts的构建
• 2.2.2 DNF409感受态细胞的制备与转化
• 3 结果与分析
• 3.1 PCR扩增左臂基因和右臂基因
• 3.2 Smr/Spcr片段的回收
• 3.3 重组质粒pDGLSR-Ts的酶切验证
• 3.4 转化子的筛选
• 3.5 PCR验证
• 3.6 双交换菌株ZL150反硝化能力检测
• 3.6.1 硝酸盐的降解情况
• 3.6.2 亚硝酸盐积累对比
• 3.6.3 亚硝酸盐的降解情况
• 4 总结与讨论
• 4.1 总结
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录