家蝇幼虫提取蛋白的抗病毒及抗肿瘤活性研究

论文摘要

抗病毒蛋白作为一类新型的潜在抗病毒药物,一直是国内外的研究热点,有学者曾报道家蝇体内含有抗病毒活性物质。家蝇（Musca domestica L.）,属于昆虫纲（Insecta）、双翅目（Diptera）、环裂亚目（Cyclorrhapha）、蝇科（Muscidae）。本文以家蝇幼虫为材料,提取了蝇蛆蛋白,检测了其抗病毒及抗肿瘤活性,主要研究结果如下：1.通过索氏提取从家蝇幼虫体内得到一种脱脂蛋白,利用伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）为靶标病毒,鸡胚成纤维细胞（CEF）为病毒载体,研究了家蝇幼虫体内粗提脱脂蛋白的抗病毒活性。研究发现,PRV病毒与粗提蛋白（0.1mg/m1）在室温下混合2小时后,滴度从原来的5.62×104（TCID50 m1-1）下降至3.16×104,说明粗提蛋白对PRV病毒存在抑制活性；感染前1小时和感染后1小时加入粗提蛋白测得的病毒滴度分别为3.16×104和1.0×104,表明粗提蛋白可能对病毒的吸附注入阶段敏感。2.研究了粗提蛋白对PRV病毒在CEF细胞上吸附注入阶段的影响作用：在病毒感染前1和2小时加入粗提蛋白,在病毒感染2小时后收集细胞培养瓶上清液,测得病毒滴度分别为5.62×104和2.51×104,上清液中仍然含有大量病毒,表明在病毒感染前加入粗提蛋白,可以影响PRV病毒对CEF细胞的吸附注入作用。3.利用离子交换色谱分离纯化家蝇幼虫粗提蛋白后回收得到2个峰,A1和A2。分别测定各组分的抗病毒活性发现,A2纯化蛋白（0.2mg/m1）在与病毒混合作用后,使病毒的滴度由5.62×104降至3.75×104,A1纯化蛋白对病毒滴度没有影响。4.利用MTT法分别对A1和A2纯化蛋白进行了抗肿瘤A549细胞的活性抑制研究,结果表明A1纯化蛋白对A549细胞没有任何作用,而A2纯化蛋白对A549细胞有明显的抑制作用,且随着A2蛋白浓度提高,抑制率上升,说明A2纯化蛋白是我们需要的目标蛋白。本实验通过对家蝇幼虫抗病毒蛋白的抗PRV病毒和抗A549肿瘤细胞的研究,为昆虫抗病毒活性蛋白的研究提供了试验依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 病毒对人类的危害及抗病毒药物的研究现状
• 1.1 病毒的危害
• 1.2 抗病毒药物的研究现状
• 2 天然抗病毒活性物质
• 2.1 抗病毒蛋白
• 2.1.1 美洲商陆蛋白
• 2.1.2 MX蛋白
• 2.2 其它抗病毒活性物质
• 3 昆虫抗病毒蛋白的研究进展
• 3.1 Melittin
• 3.2 Cecropins
• 3.3 Alloferons
• 3.4 N-Myristoylated Peptide
• 3.5 蚕体内抗病毒蛋白
• 4 抗肿瘤活性物质研究的概况
• 5 家蝇活性物质的研究现状
• 6 研究目的与意义
• 第二章 家蝇幼虫抗病毒活性蛋白的分离提取及活性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 供试虫源
• 1.1.2 供试病毒
• 1.1.3 供试十日龄鸡胚
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 家蝇幼虫活性蛋白的提取
• 1.2.1.1 脱脂蝇蛆粉的制备
• 1.2.1.2 蝇蛆蛋白的提取
• 1.2.2 蝇蛆粗提蛋白对PRV的活性
• 1.2.2.1 鸡胚成纤维细胞的原代培养
• 1.2.2.2 病毒滴度的测定
• 1.2.2.3 蝇蛆粗蛋白的细胞毒性测定
• 1.2.2.4 蝇蛆粗蛋白对PRV病毒直接钝化活性作用
• 1.2.2.5 蝇蛆粗蛋白处理细胞感染最佳条件
• 1.2.2.6 蝇蛆粗蛋白对PRV病毒吸附阶段影响作用
• 2 结果分析
• 2.1 家蝇幼虫活性蛋白的抗PRV作用
• 2.1.1 蝇蛆粗蛋白对细胞的毒性作用
• 2.1.2 蝇蛆粗蛋白对PRV病毒直接钝化作用
• 2.1.3 蝇蛆粗蛋白处理细胞感染最佳条件
• 2.1.4 蝇蛆粗蛋白对病毒吸附阶段的影响作用
• 3 讨论
• 第三章 家蝇幼虫抗病毒活性蛋白的纯化及抗肿瘤A549细胞活性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 供试虫源
• 1.1.2 供试病毒及肿瘤细胞
• 1.1.3 供试十日龄鸡胚
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 仪器设备
• 1.2 离子交换色谱DEAE-52柱层析纯化粗提蛋白
• 1.2.1 DEAE-52柱层析材料活化
• 1.2.2 平衡
• 1.2.3 装柱
• 1.2.4 上样洗脱
• 1.2.5 样品浓缩
• 1.3 纯化蛋白抗PRV活性
• 1.3.1 纯化蛋白对CEF细胞的毒性
• 1.3.2 纯化蛋白的抗PRV活性
• 1.4 纯化蛋白对肿瘤细胞A549抑制作用
• 1.4.1 肿瘤细胞A549的传代培养、冻存及复苏
• 1.4.2 纯化蛋白的对肿瘤细胞A549抑制活性
• 2 结果分析
• 2.1 离子交换色谱DEAE-52柱层析纯化结果图谱
• 2.2 纯化蛋白抗PRV活性
• 2.2.1 纯化蛋白对CEF细胞的毒性
• 2.2.2 纯化蛋白的抗PRV活性
• 2.3 纯化蛋白对肿瘤细胞A549抑制作用
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢