霸王抗旱性的分子机理及相关基因克隆研究

论文摘要

干旱是主要的环境胁迫因子之一，它严重影响着植物生长及作物产量。在干旱条件下，许多基因参与了植物对干旱胁迫的响应，然而，目前只有为数不多的基因的详尽功能得到阐明，并且这方面的大部分工作是在一年生草本模式植物如拟南芥、烟草及水稻上完成的，对林木相关的研究较少。 霸王[Zygophyllum xanthoxylum（Buage）Maxim．]属蒺藜科，为非洲起源的旱生植物，主要分布于北非，中亚及北美部分荒漠区，在我国主要分布于西北部荒漠地区和荒漠化草原地带。霸王是一种强旱生型小灌木，其自然分布区年降水量一般在50-200mm左右，300mm以上降水量很难见到霸王天然分布群落。为了研究旱生植物的抗旱机理，发掘抗旱基因，本研究以强旱生木本植物霸王为材料，通过抑制差减杂交（SSH）的方法，对霸王在干旱条件下的特异转录组进行研究，结合霸王的叶片结构和霸王在干旱条件下的生理变化，对霸王的抗旱机理进行了分析探讨；同时利用差减文库中的差异表达基因片段，采用RACE方法，克隆出5个干旱胁迫相关基因，并进行了初步的功能验证。主要研究结果如下： 1．构建了霸王在干旱条件下的差减文库并对部分基因进行了表达谱分析。以经过干旱胁迫处理的霸王叶片为目标组（Tester），正常生长条件下的霸王叶片为对照组（Driver），通过抑制差减杂交（SSH）的方法，构建了一个含有约4000个克隆的差减文库，从中挑选出经过差示筛选为阳性的400个克隆进行测序。生物信息学分析表明，所选取的400个阳性克隆大部分与已经发现的其它物种干旱胁迫相关基因在蛋白水平上有较高的相似性，还有许多功能未知的EST，根据比对结果将有显著同源性的EST根据其功能分为13个功能组。采用定量PCR的方法对部分序列所代表的基因在干旱条件下的表达谱进行了分析，结果表明干旱条件下，霸王一方面提高了合成渗透调节物质相关酶基因的转录水平，如多糖，多胺，甜菜碱等：另一方面提高了抗氧化、解毒相关酶基因（如SOD，CAT，GST等）的表达水平，这说明霸王通过提高自身的渗透调节能力与抗氧化、解毒能力来增强自身对于干旱胁迫的适应能力。 2．对霸王在干旱胁迫条件下的分子生物学及生理学研究表明，霸王在干旱条件下具有C4碳同化途径。定量PCR结果显示，在干旱条件下，霸王提高了与C4途径相关的酶如PEPC、PPT、FPT及NaDC基因的转录水平，对C4碳同化途径关键酶PEPC活性变化检测也表明干旱条件下其活性急剧升高，表明霸王在干旱条件下具有C4碳同化途

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 引言
• 1.1 植物抗旱国内外研究的现状
• 1.1.1 植物的形态结构与抗旱性
• 1.1.2 干旱条件下植物的生理生化变化及其分子生物学研究进展
• 1.1.3 植物对干旱胁迫信号感知和传导
• 1.2 差异表达基因的研究方法
• 1.2.1 差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.2.2 cDNA示差分析（cDNA-RDA）
• 1.2.3 抑制性消减杂交技术（SSH）
• 1.2.4 基因表达系列分析（SAGE）
• 1.2.5 cDNA微阵列和基因芯片（cDNA Microarray & DNA Chip）
• 1.2.6 差异基因筛选法的比较
• 1.3 本研究的目的和意义
• 第二章 霸王差减文库的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 干旱胁迫处理方法及取样
• 2.1.3 土壤含水量测定方法
• 2.1.4 游离脯氨酸含量测定
• 2.1.5 总RNA提取
• 2.1.6 mRNA分离纯化
• 2.1.7 消减文库构建
• 2.1.8 正向差减cDNA的克隆
• 2.1.9 差异表达克隆筛选
• 2.1.10 阳性克降的测序和同源性检索
• 2.1.11 部分干旱诱导基因表达谱检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 干旱条件下叶片脯氨酸含量变化
• 2.2.2 总RNA和mRNA质量检测结果
• 2.2.3 接头连接效率分析
• 2.2.4 消减效率分析
• 2.2.5 差减cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选结果
• 2.2.6 基因功能分类结果
• 2.2.7 干旱胁迫下部分基因表达谱分析
• 2.3 小结
• 2.4 讨论
• 第三章 霸王的抗旱机理分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与处理
• 4光合途径相关基因表达变化定量PCR检测'>3.1.2 C₄光合途径相关基因表达变化定量PCR检测
• 3.1.3 PEPC酶活性变化测定
• 3.1.4 石蜡切片制作
• 3.1.5 霸王PEPC蛋白与其它植物的PEPC蛋白同源性比较
• 3.2 结果与分析
• 4光合途径相关基因表达分析'>3.2.1 C₄光合途径相关基因表达分析
• 3.2.2 干旱条件下PEPC酶活性变化
• 3.2.3 霸王叶片组织结构的解剖观察结果
• 3.2.4 霸王PEPC蛋白与其它植物的PEPC蛋白同源性比较分析
• 3.3 小结
• 3.4 讨论
• 第四章 霸王抗旱相关基因的分离及其功能验证
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料与处理
• 4.1.2 RT-PCR和RACE
• 4.1.3 全长cDNA克隆与测序
• 4.1.4 干旱特异诱导型启动子Prd29A分离
• 4.1.5 基因功能验证
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 各基因5′末端和3′末端扩增结果
• 4.2.2 抗旱相关基因全长获得
• 4.2.3 测序结果及其生物信息学分析
• 4.2.4 干旱特异诱导型启动子Prd29A克隆
• 4.2.5 植物表达载体构建及拟南芥转化
• 4.2.6 转基因植株PCR检测结果
• 4.2.7 转基因植株的抗渗透胁迫能力分析
• 4.3 小结
• 4.4 讨论
• 第五章 讨论与结论
• 参考文献
• 附录A：本研究所分离出的其它基因与片段及其比对结果：
• 附录B：List of abbreviations
• 致谢