蕨麻正丁醇部位对大鼠海马神经元缺氧损伤的保护作用及机制研究

论文摘要

目的:研究蕨麻正丁醇部位对大鼠海马神经元缺氧损伤的保护作用,并探讨其可能机制。方法:①采用清洁级新生SD大鼠（出生后24h之内）,分离海马神经元,进行体外原代培养。MAP2免疫细胞化学鉴定神经元。②采用LDH检测确定海马神经元的最佳缺氧时间,建立神经元缺氧损伤模型。③通过MTT及LDH检测确定蕨麻正丁醇部位高、中、低剂量组药物浓度。细胞随机分为正常对照组、缺氧损伤模型组、蕨麻正丁醇部位0.25mg/ml、0.0625mg/ml、0.0156mg/ml干预组（缺氧同时加入蕨麻正丁醇部位）。④台盼蓝染色结合透射电镜技术研究蕨麻正丁醇部位对缺氧损伤海马神经元形态及超微结构的影响。⑤LDH检测观察不同剂量蕨麻正丁醇部位对海马神经元急性缺氧损伤的保护作用。⑥检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性及脂质过氧化代谢产物丙二醛（MDA）含量,研究蕨麻正丁醇部位对缺氧所致神经元脂质过氧化损伤的保护作用。⑦RT-PCR技术检测各实验组caspase-9、caspase-3 mRNA表达差异,免疫组织化学染色及Western Blot检测各组Cyt-c、Caspase-9、Caspase-3蛋白质表达差异。结果:1大鼠海马神经元的原代培养和形态学观察:海马神经元在培养第7d分化成熟,相差显微镜下可见神经元胞体丰满,折光性强,胞核位于细胞中央或偏于一侧,胞核及核仁清晰可见,神经元突起粗大并相互交织成网。2神经元鉴定:免疫组织化学染色检测培养细胞中神经元特异性蛋白MAP2,神经元阳性细胞计数结果显示:神经元纯度达75.2±8.1%。3模型建立:海马神经元缺氧损伤03h,细胞活性变化幅度最大,单位时间内细胞缺氧损伤程度最大,确定3h为最佳缺氧时间点。MTT法及LDH活性检测确定药物高、中、低浓度分别为0.25mg/ml、0.0625mg/ml、0.0156mg/ml。4蕨麻正丁醇部位对体外培养大鼠海马神经元缺氧损伤的保护作用:（1）MTT:高、中剂量蕨麻正丁醇部位干预组可提高缺氧神经元存活率（P<0.01）,而低剂量蕨麻正丁醇部位干预组与模型组相比无统计学差别（P>0.05）。（2）台盼蓝染色:蕨麻正丁醇部位可减少蓝染死细胞数量。（3）透射电镜:蕨麻正丁醇部位干预后,缺氧所致胞膜破裂、线粒体膜及嵴融合、粗面内质网脱颗粒、间质水肿等超微结构损伤均减轻。（4）生化指标:蕨麻正丁醇部位各剂量组可降低缺氧损伤神经元LDH外漏量（P<0.01）。5蕨麻正丁醇部位对海马神经元缺氧损伤保护作用的机制研究:（1）生化检测:蕨麻正丁醇部位干预组与模型组相比,可提高体外培养细胞外液中SOD活力（P<0.01）;但各组MDA含量无显著差异。（2）免疫组化染色:高、中、低剂量蕨麻正丁醇部位干预组与模型组相比,可降低海马神经元Cyt-c蛋白表达（P<0.01）。高、中、低剂量蕨麻正丁醇部位干预组与模型组相比,可降低海马神经元Caspase-9蛋白表达（高、中剂量组P<0.01;低剂量组P<0.05）。高、中剂量蕨麻正丁醇部位干预组与模型组相比,可降低海马神经元Caspase-3（P<0.01）蛋白表达。而低剂量蕨麻正丁醇部位干预组与模型组相比无统计学差别（P>0.05）。（3）RT-PCR:高、中、低剂量蕨麻正丁醇部位组与模型组相比,均可在mRNA水平降低缺氧海马神经元caspase-9表达（高、中剂量组P<0.01;低剂量组P<0.05）。模型组caspase-3 mRNA水平表达量较C组升高,高、中、低剂量蕨麻正丁醇部位组均可降低caspase-3 mRNA水平表达（P<0.01）。（4）Western Blot:高、中、低剂量蕨麻正丁醇部位组与模型组相比,均可在蛋白水平降低缺氧海马神经元Cyt-c表达（P<0.01）。模型组Caspase-9、Caspase-3表达量较C组升高,高、中、低剂量蕨麻正丁醇部位组均可降低Caspase-9、Caspase-3表达量（其中高、中剂量组P<0.01）。结论:蕨麻正丁醇部位能够减轻缺氧对体外培养大鼠海马神经元的损伤,减轻细胞超微结构损伤程度、减少缺氧损伤后LDH的释放,对体外培养大鼠海马神经元缺氧损伤具有保护作用。这种保护作用的机制可能为:提高机体清除氧自由基的能力;通过改善线粒体功能,降低Cyt-c释放量,使Caspases级联反应减弱,通过干预神经元凋亡和坏死两条途径阻断细胞死亡的发生。

论文目录

• 中文摘要
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• 研究论文 蕨麻正丁醇部位对大鼠海马神经元缺氧损伤的保护作用及机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 内源性凋亡中Bcl-2、线粒体及活性氧的相互作用
• 致谢
• 个人简历