论文摘要
目的: L型钙通道是电压门控离子通道,在动作电位的平台期参与心肌细胞外钙内流,并在心肌收缩偶联过程中起重要作用。心钠素是心脏分泌的一种多肽,其可下调L型钙电流,但作用机制还不清楚。本文旨在探索心钠素对小鼠胚胎干细胞分化的心肌细胞L型钙电流的调控机制。方法:应用胚胎干细胞悬滴培养的方法诱导分化为心肌细胞,利用胶原酶Ⅱ消化法获得不同时期的单个跳动的心肌细胞;利用全细胞膜片钳技术,记录心钠素刺激下心肌细胞的L型钙电流及相关信号通道的抑制剂或激活剂对L型钙电流的调控。免疫荧光法测细胞中特异蛋白ANP和肌球蛋白MHC表达;检测不同时期小鼠胚胎心脏中ANP表达水平。结果:利用悬滴法培养小鼠胚胎干细胞并分化为跳动的EB,酶消化得到了单个跳动的心肌细胞,免疫荧光检测到心肌特异的а-MHC表达,并且在早期ESMC中检测到心肌细胞动作电位和钙电流。ANP在EDS和LDS心肌细胞中对动作电位有显著负变时效应,并且能够降低EDS和LDS心肌细胞的基础的和Iso激活的L型钙电流。ANP降低ILcal途径,独立于NO途径、PTX敏感的G蛋白（Go,Gi）和可溶性GC。ANP对ILcal的抑制是通过其受体激活了颗粒性GC、cGMP依赖的PDEⅡ途径,PDEⅡ水解cAMP导致其浓度降低,减少了其调控的钙通道开放频率。RT-PCR结果显示在胚胎发育过程中ANP的表达持续升高,并且在8天胚胎中已经表达,第12天ANP强烈表达,随后ANP表达基本没变化,但是出生后分泌增多,成体后表达量降低。免疫荧光检测ANP的定位,在胚胎期在细胞质中分散表达,早期细胞ANP的表达出现极性。