肝癌基因组中乙肝病毒整合事件的研究

论文摘要

乙肝病毒（HBV）感染过程中,病毒基因组片段与宿主基因组的整合是一个非常有趣的现象。有关HBV整合的机制,目前已有的认识是：该过程与DNA双链断裂的修复相关,其在宿主基因组上的位点是完全随机的,而整合入宿主基因组的片段,也具有很大的随机性,但整体上以X Protein的整合为主。关于HBV整合对宿主细胞所存在的影响,普遍认为这一过程与肝癌的发生发展密切相关,但对其具体机制缺乏认识。以往对HBV整合的研究,主要是基于PCR的分子生物学方法,每次考察到的整合位点有限,所能提供的信息也非常有限。在北京基因组研究所的肿瘤基因组计划中,我们以全基因组数据为基础,分析了一例病人的肝癌细胞中,所存在的全部HBV整合位点,并将其与同一例病人的正常组织细胞进行对照。通过对双端测序的序列进行mapping,我们在肿瘤及正常组织中共得到了1177个与HBV整合相关的双端序列,我们对这些序列进行了分类与分析。对其中具有大量序列支持的整合位点,通过PCR实验等分子生物学方法进行了发掘。我们一共发现了264个可能的HBV整合位点,19个属于肿瘤细胞系所特有,这其中4个位于内含子区,其余位于基因间区。插入基因组的HBV片段多属于X基因或者C基因,某些插入片段还可以是HBV基因组多个区段的非连续拼接,而非简单的HBV基因组的某一连续部分。我们发现了7个与拷贝数变异紧密联系的HBV整合位点,他们都正好出现于拷贝数变化的边界上。通过对整合位点周边的杂合位点进行Sanger测序,我们发现HBV整合所关联的拷贝数变异以独立于两条原始染色体的形式存在。同时,CNV偶联的HBV整合位点拷贝数同样高于其它HBV整合位点,这表明HBV整合和CNV同时出现。CNV区域中出现的CCNDl等几个癌基因,提示了HBV整合-拷贝数变异-体细胞癌变之间的关系。在对HBV整合情况在肿瘤和正常组织中的差别进行分析时,我们还发现正常组织的HBV整合位点较肿瘤组织而言,更为分散。这提示了正常组织是由更多数量的小克隆群体构成,而HBV整合则可作为这些克隆群体的遗传标记。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 HBV概述
• 1.2 HBV在宿主基因组中的整合
• 1.3 肝脏的结构与发育
• 1.4 HBV与肝癌
• 1.5 第二代测序技术简介
• 1.6 研究HBV整合位点的方法
• 1.7 国内外研究现状
• 1.8 本论文组织结构
• 第二章 基于全基因组测序数据的乙肝病毒整合事件研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 临床病例
• 2.1.2 全基因组测序
• 2.1.3 测序数据的mapping
• 2.1.4 PCR、Inverse-PCR、接头连接-PCR、单引物PCR
• 2.1.4.1 Inverse-PCR
• 2.1.4.2 接头连接-PCR
• 2.1.4.3 单引物PCR
• 2.2 结果
• 2.2.1 测序数据的mapping
• 2.2.2 被HBV整合的基因
• 2.2.3 HBV整合入宿主基因组的片段
• 2.2.4 PCR、Inverse-PCR、接头连接-PCR、单引物PCR
• 2.2.5 HBV整合所揭示出的肿瘤细胞克隆性
• 第三章 乙肝病毒整合与拷贝数变异
• 3.1 HBV整合与CNV共同出现
• 3.2 位于拷贝数变异区域的基因
• 3.3 QPCR证实拷贝数变异的存在
• 3.4 整合位点周边杂合位点测序显示HBV整合与CNV的关系
• 第四章 结论
• 4.1 本论文的结论
• 4.1.1 HBV整合与癌症的关系
• 4.1.2 HBV整合与CNV的关系
• 4.1.3 HBV整合位点与肝细胞谱系
• 4.1.4 使用PCR技术发掘HBV整合位点
• 4.2 本论文的创新之处和研究意义
• 4.3 本研究存在的不足和未来研究展望
• 参考文献
• 简历
• 致谢