以MRSA多重耐药蛋白PBP2a为靶点从中药中寻找抗菌增敏剂的实验研究

论文摘要

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）是医院感染的重要病原菌,也是引起烧伤、严重创伤后感染的最常见致病菌之一。在金黄色葡萄球菌感染中,MRSA所致的医院感染越来越流行,尤其在ICU、烧伤病房等,MRSA的检出率都有明显增高趋势,最高可达90%以上,给临床治疗护理工作带来了极大的困难。其中,老年患者、危重病患者、免疫功能低下者及新生儿等是MRSA感染的高危人群;长期使用抗生素,侵入性操作以及消毒隔离措施等医源性因素均可导致MRSA感染率增加。MRSA的耐药机制主要与其mecA基因大量表达产生的一种特殊青霉素结合蛋白PBP2a有关,该蛋白由668个氨基酸组成,分子量为76.1 kDa,对所有β-内酰胺类抗生素亲和力低。水溶性的PBP2a为去除N-末端23个氨基酸后的蛋白质（不影响PBP2a与β-内酰胺类抗生素的结合）,含有两个功能域:N-末端非青霉素结合域（24326 aa）,负责蛋白的延伸和锚定;C-末端功能域（327668 aa）,具有转肽酶活性和β-内酰胺酶的作用。当β-内酰胺类抗生素抑制了由敏感金葡菌产生的PBPs时,PBP2a可以替代其转肽酶功能,继续维持细菌细胞壁的合成,表现出耐药性。MRSA临床分离株大多是多重耐药,仅对糖肽类抗生素如万古霉素敏感。然而,随着其广泛应用,已出现一些耐万古霉素金黄色葡萄球菌的报道。1996年在日本分离到万古霉素中度敏感的MRSA,随后2002年在美国发现了万古霉素耐药的MRSA,至今尚无其它治疗MRSA感染的有效药物。所以,更新研究策略、寻找新的药物来抑制PBP2a的活性,恢复MRSA对抗生素的敏感性或降低MRSA耐药性具有十分重要的临床意义。目的本研究基于PBP2a在MRSA耐药机制中的重要性,拟从MRSA临床分离株中获得多重耐药蛋白PBP2a,以此为靶点应用生物传感器技术筛选具有与PBP2a高结合力的中药,从中药中寻找抗菌增敏剂,恢复抗生素的敏感性,为MRSA感染的防治研究提供新的策略。方法1.可溶性重组蛋白PBP2a的表达、纯化与鉴定:采用PCR方法从MRSA临床分离株中扩增编码PBP2a可溶性全片段的mecA基因（762007 bp）,构建原核表达载体pQE30-mecA,经酶切鉴定后进行DNA测序;将pQE30-mecA转化入大肠杆菌M15并诱导表达PBP2a可溶性全片段,对重组蛋白PBP2a进行Ni2+亲和层析纯化后,测定其纯度;并进行氨基酸测序与分子量鉴定。然后,对PBP2a的生物学活性与结合活性进行评价。采用分光光度法对PBP2a分别进行转肽酶及β-内酰胺酶活性测定,并通过二倍微孔稀释法与激光共聚焦技术观察PBP2a与抗生素的体外结合作用。2.以PBP2a为靶点筛选拮抗MRSA的中药:将PBP2a包被于生物传感器的样品池作为固相配基,通过对26种中药水煎液与PBP2a结合活性的测定,选择结合力较高的10种中药,再结合直接抗菌实验,以及10种中药与苯唑西林的联合抗菌实验,筛选出对MRSA具有抗菌增敏作用的中药。3.夏枯草中对MRSA抗菌增敏组分的分离提取及活性评价:首先通过生物传感器测定夏枯草不同部位水煎液与PBP2a的结合活性,再经联合抗菌实验对它们的抗菌效果进行初步测定;利用AB-8大孔吸附树脂分离富集夏枯草全草水煎液中的有效组分,追踪检测其与PBP2a的结合力,通过抗菌实验与联合抗菌实验确定抗菌增敏组分,并对其物质属性进行鉴定;观察其与苯唑西林联用的抑菌曲线、与β-内酰胺类抗生素的联合抗菌作用,然后通过透射电镜观察其对MRSA细菌形态的影响,评价可能的抗菌作用机制。结果1.成功扩增出mecA基因片段（762007bp）,构建了重组质粒pQE30-mecA,基因序列分析表明,mecA基因片段的大小与预期一致,但序列中出现了9个碱基突变,所编码蛋白质与GenBank收录的蛋白质同源性为96%;在大肠杆菌M15中实现了可溶性PBP2a的高效表达,经分离纯化后得到的重组蛋白PBP2a纯度达到90.6%;蛋白质N端15个氨基酸测序结果为:MRGSH HHHHH GSKDK,与预期一致;质谱分析其相对分子质量约为74 kDa,与预期相符;所获得的重组蛋白PBP2a具有转肽酶活性与β-内酰胺酶活性,并且在体外与β-内酰胺类抗生素具有一定的结合活性。2.成功地将PBP2a包被于生物传感器的羧甲基葡聚糖样品池上,从26种中药中筛选了10种与PBP2a有较高结合力的中药;体外抗菌实验显示,黄芩、夏枯草、黄连对MRSA的单独抗菌效果较好;10种中药与苯唑西林的联合抗菌实验显示,夏枯草与苯唑西林的联合抗菌效果最好。3.夏枯草的全草与果穗中均含有与PBP2a具较高结合力的活性成分,其抗菌效果差别不明显;夏枯草全草水煎液经过AB-8大孔吸附树脂分离富集,得到SP2组分;SP2组分不仅与PBP2a具有较高的结合力,而且与苯唑西林联用能够明显抑制MRSA的生长速度;可以使苯唑西林、青霉素、舒氨西林、氨苄西林对MRSA的MIC分别降低256、8、16及4倍,SP2与苯唑西林、青霉素、舒氨西林、氨苄西林的FIC分别为0.007、0.151、0.064、0.276;SP2能够通过破坏MRSA的细胞壁结构发挥抗菌增敏作用;SP2为水溶性组分,含有大量的酚羟基类物质,其有效成分的分子量范围大约为35kDa。结论采用基因重组技术,成功实现了MRSA临床分离株中可溶性PBP2a的高效表达;以多重耐药蛋白PBP2a为靶点,应用生物传感器建立了筛选拮抗MRSA中药的技术平台。利用该平台,我们从26种中药中筛选出与PBP2a有较高结合力、与苯唑西林联合抗MRSA效果最好的夏枯草;进一步从夏枯草全草水煎液中分离得到水溶性有效组分SP2,SP2具有恢复β-内酰胺类抗生素对MRSA敏感性的作用;SP2组分中有效成分的分子量范围大约为35kDa,有望通过进一步的分离纯化得到有活性的小分子化合物作为抗菌增敏剂,为MRSA感染防治提供新的方法。

论文目录

• 英文缩写一览表
• Abstract
• 中文摘要
• 论文正文 以MRSA 多重耐药蛋白PBP2a 为靶点从中药中寻找抗菌增敏剂的实验研究
• 前言
• 第一部分 重组蛋白PBP2a 的表达、纯化与活性鉴定
• 实验一 mecA 基因的克隆与原核表达载体的构建
• 实验二 可溶性重组蛋白PBP2a 的表达
• 实验三 重组蛋白PBP2a 的纯化与鉴定
• 实验四 重组蛋白PBP2a 的活性鉴定
• 第二部分 以PBP2a 为靶点筛选拮抗MRSA 的中药
• 实验一 以PBP2a 为靶点筛选抗MRSA 中药技术平台的建立
• 实验二 26 种中药水煎液与PBP2a 的结合活性测定
• 实验三 10 种中药水煎液对MRSA 的直接抗菌作用
• 实验四 10 种中药水煎液与苯唑西林的联合抗MRSA 作用
• 第三部分 夏枯草中对MRSA 抗菌增敏组分的分离提取及活性评价
• 实验一 夏枯草不同部位水煎液的抗菌作用
• 实验二 夏枯草水煎液中抗菌增敏组分的分离及物质鉴定
• 实验三 SP2 组分的抗菌增敏活性评价
• 全文结论
• 致谢
• 附图
• 参考文献
• 文献综述 MRSA 的耐药机制及防治研究进展
• 参考文献
• 研究生期间发表的文章和申请的专利
• 英文论著