重组腺病毒HIF-1α基因治疗脑缺血的实验研究

论文题目: 重组腺病毒HIF-1α基因治疗脑缺血的实验研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 神经病学

作者: 陶陶

导师: 胡长林

关键词: 缺氧诱导因子,脑缺血,重组腺病毒,载体扩增,载体纯化,腺病毒载体,基因治疗

文献来源: 重庆医科大学

发表年度: 2005

论文摘要: 目的:应用最新的腺病毒载体构建系统 AdEasy System 构建含 HIF-1α基因的重组腺病毒质粒 pAdHIF-1α及其对照重组腺病毒空载体质粒pAd,为进一步应用其进行脑缺血的基因治疗奠定基础。方法:应用 AdEasy System 腺病毒载体构建系统,将 PCR 扩增所得的 HIF-1α基因片段与穿梭质粒 pAdTrack-CMV 进行连接,获得重组穿梭质粒 pAdTrack-CMV-HIF-1α,酶切鉴定,将目的基因 HIF-1α 进行序列测定,硷裂解法提质粒,酶切使其线性化后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 用电穿孔法共同转化到 BJ5183 菌。将重组腺病毒质粒以酶切、PCR 及脉冲场电泳方法进行鉴定。结果:重组腺病毒质粒经 PacⅠ酶切后可见一条 4.5kb(3.0kb)和一条约 30kb 的条带,表明同源重组成功。将 pAdHIF-1α PCR 产物进行测序检查,证明所扩增条带为 HIF-1α。结论:我们已成功构建了含有 HIF-1α基因的重组腺病毒质粒pAdHIF-1α及其对照重组腺病毒空载体质粒 pAd。目的:建立重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定的有效方法,为进一步应用重组腺病毒 HIF-1α对大鼠脑缺血的基因治疗打下基础。方法:应用人胚肾 293 细胞作为包装细胞,将重组腺病毒质粒线性化,然后转染 293 细胞包装出重组腺病毒 AdHIF-1α/Ad,。于荧光显微镜下观察绿色荧光以确定转染结果。用 293 细胞包装并扩增下一步实验所需的重组腺病毒,用 GFP 及有限稀释法进行病毒滴度和感染靶细胞的感染效率的测定,采用氯化铯梯度离心法纯化病毒并提高病毒的滴度。利用病毒透析袋透析病毒,去除氯化铯,以减少体内实验中由此带来的毒副作用。采用 Western Blotting 法检测重组腺病毒 AdHIF-1α 中的目的基因 HIF-1α的表达。结果:将两组线性化重组腺病毒质粒转染 293 细胞后,于荧光显微镜下均可观察到明确的绿色荧光,扩增的 AdHIF-1α的滴度:6.6×108pfu/mL, Ad 的滴度:8.2×108pfu/mL, 经氯化铯梯度离心后 AdHIF-1α的滴度为 8.4×109pfu/mL; Ad 的滴度为 9.6×109pfu/mL。对不同组织来源的细胞株,AdHIF-1α的感染效率是不相同的。对正常细胞的感染效率极低, 采用 Western Blotting 法检测重组腺病毒 AdHIF-1α 中有目的基因 HIF-1α的表达。

论文目录:

符号说明

中文摘要

英文摘要

论文正文：重组腺病毒 HIF-1α基因治疗脑缺血的实验研究

第一部分重组腺病毒 HIF-1α的构建

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分重组腺病毒 AdHIF-1α/Ad 的扩增、纯化及滴度测定

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第三部分重组腺病毒 HIF-1α对大鼠脑缺血的基因治疗

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述

致谢

攻读博士期间撰写或发表的文章目录

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].腺病毒介导GRIM19诱导人胶质瘤细胞分化及相关机制的实验研究[D]. 姚声涛.重庆医科大学2009
[2].PTEN基因重组腺病毒治疗脑胶质瘤的实验研究[D]. 郑克彬.河北医科大学2011

重组腺病毒HIF-1α基因治疗脑缺血的实验研究

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