多发性硬化患者血清差异蛋白质组学研究

论文摘要

目的:多发性硬化是一种以中枢神经系统的白质脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫性疾病,其病理特点是CNS白质内不规则髓鞘脱失和胶质增生,其发病机制尚不清楚。诊断多发性硬化需要根据患者的病史、症状、体征、实验室检查、磁共振检查等综合判断。目前还没有发现多发性硬化患者血清中特异的生物标记物。随着人类基因组计划的完成,人们己经意识到,基因组学（genomics）虽然在基因活性和疾病的相关性方面为人类提供了有力根据,但是基因的表达方式错综复杂,同样的一个基因在不同条件、不同时期可能会起到完全不同的作用。正是在这种情况下,后基因组计划应运而生,其中包括功能基因组、蛋白质组、转录组等多个研究领域。其中,蛋白质组的研究,由于其针对直接发挥生物学作用的蛋白质进行大规模、高通量的分析而备受瞩目。蛋白质组（proteome）的概念源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合。蛋白质组的定义是:一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套的蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是以蛋白质组为研究对象,大规模、有系统地研究蛋白质的特征及结构,包括细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平和翻译后修饰状态、蛋白质之间的相互作用和联系。应用荧光差异显示凝胶电泳结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱分析多发性硬化患者、视神经脊髓炎患者以及健康对照组血清中的差异蛋白,以寻找多发性硬化患者血清中特异的生物标记物。并对多发性硬化的发病机制进行进一步探讨。方法:1.实验分组MS组:选取河北医科大学第二医院住院的多发性硬化患者5例,诊断符合Poser（1983）多发性硬化诊断标准的临床确诊多发性硬化和实验室检查支持确诊多发性硬化。NMO组:同期于河北医科大学第二医院住院的视神经脊髓炎患者5例,诊断符合2006年Wingerchuck NMO诊断标准。健康对照组:健康体检者5例。抽取空腹静脉血约4毫升,收集血清,-80℃保存备用。2.去除高丰度蛋白、冷丙酮沉淀血清蛋白质在组成上至少具有1万种以上蛋白形式,且大多数以极低丰度存在。而低丰度蛋白的识别十分重要,因为许多低丰度蛋白往往行使着非常重要的作用,但由于血清中高丰度蛋白包括白蛋白,免疫球蛋白及转铁蛋白的存在,会掩盖低丰度蛋白。所以血清中高丰度蛋白的有效去除是血清蛋白质组研究要解决的关键问题。应用去除高丰度试剂盒去除血清中的白蛋白,免疫球蛋白等高丰度蛋白,血清与4倍体积-20℃丙酮混合2小时,除盐。3.蛋白定量Bradford法进行蛋白定量4.荧光标记双向电泳用荧光染料Cydye cy2标记三组血清的混合物,作为内标,三组血清分别用cy3、cy5进行正反标记,跑第一向IEF等电聚焦,使血清中的蛋白质按等电点分离,等电聚焦结束以后,胶条进行两步平衡,之后第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳,在Eatten DALT Six上进行,使血清中的蛋白质按分子量的不同分离开,用typhoon 9410扫描仪激发荧光染料,扫描胶图,用Decyder分析软件对胶图中的蛋白质点进行统计学分析,找到差异点,用反射式基质辅助激光吸附飞行时间串联质谱对差异蛋白质点进行鉴定,最后进行数据库搜索,鉴定出相应的蛋白质。结果:1.本次实验通过应用二维差异荧光凝胶电泳技术对多发性硬化患者及其对照组血清进行分离,得到MS及其对照组的双向电泳图谱。2.本实验运用荧光差异双向凝胶电泳技术成功的对多发性硬化患者和视神经脊髓炎患者的血清蛋白进行了分离,获得22个差异蛋白质点。应用基质辅助激光吸附飞行时间串联质谱技术鉴定出了a-1酸性糖蛋白1前体,a-1抗胰蛋白酶前体、补体C3前体片段、非依赖ATP的26S蛋白酶体前体、载脂蛋白A1前体、载脂蛋白J、结合珠蛋白、免疫球蛋白M u重链疾病蛋白、免疫球蛋白J链、免疫球蛋白C区域、免疫球蛋白k链、Felic蛋白、187kD蛋白等15种蛋白。结论:本研究鉴定了15种与多发性硬化疾病有关的特异蛋白,并对这些蛋白的功能以及它们与多发性硬化的关系进行了初步的分析,但这15种蛋白质与多发性硬化的确切关系有待进一步探讨。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 多发性硬化患者血清差异蛋白质组学研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 参考文献
• 综述 蛋白质组学技术及其在多发性硬化中的应用
• 致谢
• 个人简历