小地老虎几丁质代谢酶基因的克隆及分子特性研究

论文摘要

目前已分离出一些昆虫几丁质酶,并且已将昆虫几丁质酶基因导入到植物中以增强植物的抗虫性,及将几丁质酶嵌入到昆虫病原体内,增强昆虫病原体对害虫的为害。本文从小地老虎体内分离和表达了几丁质代谢相关酶基因,详细了解其分子特性对研究和开发几丁质代谢相关酶为基础的杀虫剂是十分必要的。从预蛹期小地老虎体内分离出两条几丁质酶基因cDNA序列,一条是全长基因序列,另一条是包含5’端的基因片段。全长的小地老虎几丁质酶基因cDNA序列长度为2823bp,包括1677个碱基的开放读码框,编码558个氨基酸,分子量为62.5 kDa。5’端的几丁质酶基因cDNA序列片段长度为1082bp,编码360个氨基酸。由全长几丁质酶基因推导的氨基酸序列包含两个保守区域,一个是N-端的高度保守的几丁质催化区,另一个是C-端包括六个半胱氨酸的几丁质结合区。在催化区和几丁质结合区中间有一个被称为Linker的富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸和谷氨酸的区域（PEST富集区）。预测其成熟期蛋白的N-端还含有一个疏水性的信号肽。从已发现昆虫几丁质酶基因推导的氨基酸序列中的N-位和O-位糖基化的位点的确定,对于研究昆虫蛋白的分泌和维持其稳定性是必要的。利用PROSCAN和NetOGlyc 2.0软件发现在小地老虎几丁质酶氨基酸序列中有2个N-位糖基化位点和20个O-位糖基化位点。从预蛹期小地老虎体内分离出两条包含3’端的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。其中一条的长度为2267bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.6kDa。另一条的长度为2278bp,包括1509个碱基的开放读码框,编码503个氨基酸,分子量为57.5kDa。两条β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因推导的氨基酸序列都包含两个保守区,一个是N-端的水解催化区,另一个是C-端的水解结合区。利用PROSCAN和NetOGlyc 2.0软件发现在两条小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列中都有3个N-位糖基化位点和1个O-位糖基化位点。从取食期小地老虎体内分离出一条几丁质合成酶基因cDNA序列,长度为975bp,包括792个碱基的开放读码框,编码264个氨基酸,分子量为30.0kDa。利用BLAST搜寻出许多与小地老虎几丁质酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为80%,与棉铃虫同源性为85%,与美国白蛾同源性为83%,与斜纹夜蛾同源性为89%。序列比对表明小地老虎几丁质酶基因与其他鳞翅目昆虫的几丁质酶基因显示高同源性（75%以上）。利用BLAST搜寻出与小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应片段推导的氨基酸序列同源性为73%,与草地贪夜蛾同源性为37%,与玉米螟同源性为74.4%。利用BLAST搜寻出与小地老虎几丁质合成酶基因具有高同源性的昆虫基因。其推导的氨基酸序列与烟草天蛾相应序列推导的氨基酸序列同源性为79%,与甘蓝夜蛾同源性为92%,与甜菜夜蛾同源性为89.4%。克隆出的小地老虎几丁质代谢相关酶基因的cDNA序列已分别登录在GenBank上,登录号分别为:几丁质酶基因EU035316,EU622802;β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因EU622803,EU622804;几丁质合成酶基因EU601174。利用RT-PCR方法对小地老虎体内不同时期的几丁质代谢酶基因的时空表达进行了研究。结果表明,幼虫蜕皮和预蛹期有几丁质酶和β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶的mRNA表达,而在幼虫取食期只有几丁质合成酶的mRNA表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 几丁质
• 1.1.1 几丁质的结构
• 1.1.2 昆虫中几丁质的发现
• 1.2 几丁质代谢相关酶
• 1.2.1 几丁质合成及几丁质合成酶
• 1.2.2 几丁质降解及几丁质降解酶
• 1.3 应用及前景
• 1.4 国内外研究现状
• 1.4.1 昆虫几丁质代谢相关酶cDNA 的克隆
• 1.4.2 昆虫几丁质代谢相关酶基因在虫体内的表达
• 1.4.3 昆虫几丁质代谢相关酶基因的体外表达
• 1.4.4 昆虫几丁质代谢相关酶的基因的拷贝数研究
• 1.5 昆虫几丁质代谢相关酶的研究展望
• 1.6 小地老虎介绍
• 1.7 本论文研究的目的和意义
• 1.7.1 研究目的
• 1.7.2 研究意义
• 1.8 本研究课题的来源及主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 仪器设备
• 2.1.5 昆虫来源
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 总RNA 提取
• 2.2.1.1 提取过程
• 2.2.1.2 所抽提的RNA 的质量检测
• 2.2.1.3 RNA 的纯化
• 2.2.2 利用RT-PCR 扩增保守区之间的cDNA 序列
• 2.2.2.1 第一链cDNA 的合成
• 2.2.2.2 PCR 反应
• 2.2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.2.4 DNA 回收
• 2.2.2.5 连接反应
• 2.2.2.6 JM109 感受态细胞制备
• 2.2.2.7 E. coli 的转化
• 2.2.3 RACE 引物设计
• 2.2.3.1 几丁质合成酶RACE 引物设计
• 2.2.3.2 几丁质酶RACE 引物设计
• 2.2.3.3 β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶RACE 引物设计
• 2.2.4 3′-RACE 的实验步骤
• 2.2.5 5′-RACE 的实验步骤
• 2.2.5.1 去磷酸化处理
• 2.2.5.2 去帽子反应
• 2.2.5.3 5′-RACE Adaptor 的连接
• 2.2.5.4 反转录反应
• 2.2.5.5 Outer PCR 反应
• 2.2.5.6 Inner PCR 反应
• 2.2.5.7 以下步骤与RT-PCR 扩增保守区之间的cDNA 序列的步骤相同
• 2.2.6 全长cDNA 的获取及其序列分析
• 2.3 cDNA 序列分析
• 2.3.1 利用Blast 软件进行序列相似性检索
• 2.3.2 分子质量、碱基组成、碱基分布
• 2.3.3 全长cDNA 可读框架分析
• 2.3.4 对ORF 进行限制性酶切分析
• 2.3.5 核酸序列对齐分析的功能预测
• 2.3.5.1 NCBI/Blast 软件的核酸序列同源性分析
• 2.3.5.2 核酸序列之间的多重比对分析及进化分析
• 2.4 蛋白质基本性质分析
• 2.4.1 疏水性分析
• 2.4.2 信号肽分析
• 2.5 蛋白质功能预测
• 2.5.1 蛋白质序列同源性分析及蛋白质功能预测
• 2.5.2 结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测
• 2.6 蛋白质结构预测
• 2.6.1 蛋白质二级结构预测
• 2.6.2 蛋白质三级结构预测
• 2.7 不同生长发育时期几丁质代谢酶基因表达水平研究
• 2.7.1 总RNA 的提取
• 2.7.2 cDNA 第一链的合成
• 2.7.3 肌动蛋白全长基因的克隆与表达引物设计
• 2.7.3.1 利用RT-PCR 扩增保守区之间的cDNA 序列
• 2.8 几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达研究
• 2.8.1 几丁质酶基因cDNA 序列ORF 的PCR 反应
• 2.8.2 PCR 产物酶切反应
• 2.8.3 E.coli 质粒DNA 提取和酶切
• 2.8.4 大肠杆菌表达载体构建
• 2.8.5 几丁质酶基因在大肠杆菌中诱导表达
• 2.8.6 SDS-PAGE 电泳
• 3 结果与分析
• 3.1 几丁质代谢酶RNA 的提取
• 3.1.1 RNA 完整性的检测
• 3.1.2 纯度及产量检测
• 3.2 RT-PCR 得到几丁质代谢酶的基因特异性片段及序列分析
• 3.2.1 几丁质合成酶的基因特异性片段及序列分析
• 3.2.2 几丁质酶的基因特异性片段及序列分析
• 3.2.3 β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶的基因特异性片段及序列分析
• 3.3 基因cDNA 序列的3’-RACE 结果
• 3.3.1 几丁质酶基因cDNA 序列的3’-RACE 结果
• 3.3.2 β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA 序列的3’-RACE 结果
• 3.4 几丁质酶基因cDNA 序列的5’-RACE 结果
• 3.5 基因cDNA 序列的获得
• 3.5.1 几丁质合成酶基因cDNA 序列和氨基酸序列
• 3.5.2 几丁质酶基因全长cDNA 序列和氨基酸序列
• 3.5.3 β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA 序列和氨基酸序列
• 3.6 三种几丁质代谢酶基因特征
• 3.6.1 碱基序列组成分析
• 3.6.2 氨基酸序列组成分析
• 3.6.3 信号肽分析
• 3.6.4 推导的氨基酸序列二级结构预测
• 3.7 氨基酸结构域预测
• 3.7.1 几丁质合成酶氨基酸结构域预测
• 3.7.2 几丁质酶氨基酸结构域预测
• 3.7.3 β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸结构域预测
• 3.8 几丁质代谢酶氨基酸的疏水性分析
• 3.9 序列同源性比较
• 3.9.1 合成酶基因与其它几种鳞翅目昆虫的相应片段同源性比较
• 3.9.2 几丁质酶基因与其它几种鳞翅目昆虫的同源性比较
• 3.9.3 β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因与其它几种鳞翅目昆虫相应片段的同源性比较
• 3.9.4 聚类分析
• 3.9.4.1 克隆的合成酶基因与已发表的昆虫合成酶基因的聚类分析
• 3.9.4.2 几丁质酶基因与已发表的昆虫几丁质酶基因的聚类分析
• 3.9.4.3 克隆的β-氮-乙酰葡糖胺糖苷酶基因与已发表的其它几种鳞翅目昆虫相应片段的聚类分析
• 3.10 小地老虎几丁质代谢酶基因表达水平研究
• 3.10.1 肌动蛋白全长基因序列的获得与表达引物的设计
• 3.10.2 不同发育时期的表达水平
• 3.11 几丁质酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.11.1 大肠杆菌重组表达载体的构建和鉴定
• 3.11.2 几丁质酶基因在大肠杆菌中的融合表达
• 4 讨论
• 4.1 几丁质代谢酶基因拷贝数的探讨
• 4.2 利用肌动蛋白进行RT-PCR 定性研究的探讨
• 4.3 几丁质降解酶表达系统的选择
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文