球孢白僵菌孢壁蛋白相关的耐热分子机理及其耐热性状的遗传改良

论文摘要

丝孢类杀虫真菌是害虫微生物防治的重要资源，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）为其典型代表。环境温度是影响生防真菌孢子制剂贮存和应用的关键因素之一，而菌剂生产所用菌种对热胁迫的生物学反应决定着菌剂的田间生态适应性。本研究从建立生防真菌孢子耐热性的定量评价技术体系入手，通过分析揭示孢壁类疏水蛋白含量与孢子耐热力之间的关系，发现了与孢子耐热性密切相关的几种孢壁蛋白，由此提出了“孢壁结构蛋白参与孢子耐热性状”的生物学假设。在此基础上，对一种同孢子耐热性状相关密切的全新孢壁蛋白进行了基因克隆，获得了该基因的全序并证明它是一个全新基因。通过建立基于球孢白僵菌芽生孢子的新型遗传转化体系和应用反义RNA技术，证明新基因的缺失使孢子耐热力显著降低。利用上述转化体系和模式微生物的抗逆功能基因对球孢白僵菌进行遗传改良，获得耐热性状明显提高的重组菌株。这些研究催生了有助于球孢白僵菌功能基因分析和菌株遗传改良的技术平台，主要内容和结果分述如下：孢子耐热生物学和FAE蛋白研究建立了以48℃为胁迫温度的分生孢子耐热力的测定方法和定量评价体系。该体系引入一个全新的变量——残存指数Is，是指孢子在48℃胁迫下不同时刻的残存活孢率与未经胁迫的孢子萌发率的比值。球孢白僵菌和玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）共11个菌株的残存指数随胁迫时间的衰变过程均很好地拟合逻辑斯蒂模型（r2≥0.97，P＜0.01）。根据所拟合各菌株的模型，6株球孢白僵菌孢子的致死中时LT50平均为40.7（10.1～61.9）min，而5株玫烟色拟青霉的LT50平均为4.6（2.8～6.2）min。培养基成分和培养条件均可影响生防真菌孢子的耐热力。以蛋白胨作为氮源时，2～4％葡萄糖为最优，2％蔗糖次之，淀粉最差；以硝酸铵代替蛋白胨作为氮源时，4％葡萄糖为最优，1％淀粉次之，蔗糖最差。以萨氏培养基SDAY作为基本培养基时，25℃和pH 5～6的条件适合生产更耐热的孢子，这与白僵菌最适的生长条件基本一致。基础培养基中终浓度为≤50μg／mL的Mn2+作为离子添加剂，有助于提高孢子的耐热力，但添加Fe3+和Cu2+则显著降低孢子的耐热力，而不超过150gg／mL的Zn2+对孢子耐热力的影响不显著。孢子耐热力随孢内离子含量增高而下降。分生孢子孢壁类疏水蛋白即可甲酸抽提的（formic-acid-extractable，缩写FAE）蛋白含量在所测定的不同菌种和菌株间差异显著。培养基成分和培养条件可影响生防真菌孢子FAE蛋白的累积。以蛋白胨作为氮源时，孢壁FAE蛋白含量随着葡萄糖或蔗糖浓度从0.5％增至2％而达最高，而随淀粉浓度增至2％下降，并随淀粉浓度进一步增高而呈现波动；以硝酸铵代替蛋白胨作为氮源时，FAE蛋白含量随着葡萄糖或蔗糖浓度从0.5％增至2％而达最高，随着淀粉浓度增高至1％而达最高。金属离子浓度低于50μg／mL，FAE蛋白含量均有不同程度下降，在50～200μg／mL范围内则保持相对稳定或略增，但高于200μg／mL则显著升高。SDS-PAGE分析显示，同一菌种内FAE蛋白组分无明显变化。球孢白僵菌孢子FAE蛋白中的15.0和17.5 kDa蛋白属组成型表达，而12.0 kDa蛋白受培养基成分和培养条件影响较大。以蛋白胨作为唯一氮源时，FAE蛋白中的12.0 kDa条带仅出现在低浓度葡萄糖或蔗糖的条件下，但不受淀粉的影响。以硝酸铵代替蛋白胨后，12.0 kDa蛋白的表达则不受碳源种类及其浓度的影响。12.0 kDa蛋白的表达受Mn2+、Cu2+和Zn2+抑制，而不受Fe3+影响。培养基中的pH、水活度及培养溫度对FAE蛋白组分表达无明显影响。相关性分析显示，各菌株在48℃热胁迫下的耐热力指数LT50（y）与孢壁FAE蛋白含量呈显著指数相关（拟合模型y=exp（0.762+0.137x），r2=0.81；F=37.5，P＜0.01）。源于不同氮源和碳源的孢子在48℃下胁迫45 min后的残存指数Is也与相应孢子的FAE蛋白含量具有显著的指数相关性（r2≥0.80，P＜0.01）。在不同温度、pH、水活度和金属离子等条件下培养，所获孢子的耐热力与孢子FAE蛋白含量之间不存在显著相关性。综合分析表明，孢子FAE蛋白可能参与孢子耐热性状，其中15.0或17.5 kDa蛋白参与的可能性更大。这种相关性主要受培养基碳氮源影响，而其它因素不仅影响孢子FAE蛋白，还可能影响孢子耐热生理机制的其它方面。耐热相关类疏水蛋白的基因克隆与分析选择最有可能参与孢子耐热性状的15.0kDa蛋白（记为BCW15）作为研究对象，开展蛋白纯化、N-端测序、基因克隆和结构分析。结果发现，BCW15蛋白可选择性地溶解于30％乙腈溶液中而得到较好的分离。所分离的BCW15蛋白经SDS-PAGE分离后转印至PVDF膜，测得其N端11个氨基酸的序列为SFPGGQFIIRN。根据N端氨基酸序列设计简并引物，采用3′-RACE技术和YADE技术获得了该基因的编码序列和部分启动子序列，命名为BCW15。经联网检索分析证明，BCW15是第一个具有完整编码信息的球孢白僵菌孢壁蛋白基因，含有长393 bp的开放阅读框，编码131个氨基酸，无信号肽序列。采用3′-RACE方法得到两条长约500 bp和600 bp的扩增产物。它们的编码区和绝大部分非编码区序列是一致的，末端少部分序列却存在差异。本研究未能克隆到BCW15基因的启动子序列，却发现其上游序列是富含AT的区域。基因BCW15基因组序列不含内含子，在球孢白僵菌基因组中存在着双拷贝。对六株不同地理和寄主来源球孢白僵菌的BCW15氨基酸序列的分析证明，BCW15含有高度保守的序列HNDRVVGAWDQDVKIV，而且存在多样性，可分为BCW15a和BCW15b两类。这意味着BCW15基因有可能作为球孢白僵菌系统进化研究的新的分子标记。构建基于芽生孢子的遗传转化体系为了证明上述新基因的功能，首先研究建立了以球孢白僵菌芽生孢子为载体的全新丝孢类真菌遗传转化体系。以察氏培养基为基本培养基，终浓度200μg／mL的草丁膦作为转化子筛选的选择压，构建了含有草丁膦抗性基因bar和绿色荧光蛋白基因exfp的双元质粒pABeG验证转化体系。球孢白僵菌在限氮液体培条件下产生的芽生孢子经0.1 mol／L LiAc处理后成为感受态细胞。质粒pABeG在PEG介导下转入芽生孢子。芽生孢子的转化效率为24±4.58转化子／μg质粒DNA（n=3）。所有随机选取的转化子在离体生长和侵染寄主过程中均能稳定地表达绿色荧光蛋白基因。继之，成功构建了bar基因的Poly A陷阱质粒pUCBAR-TF和pUCBAR-TR，结合REMI技术，使陷阱质粒pUCBAR-TF经芽生孢子转化单位点插入到球孢白僵菌的基因组DNA中。这一技术有利于分离和鉴定表型相关基因，也是Poly A陷阱技术在杀虫真菌中标记基因的首次应用。芽生孢子转化法大大简化了球孢白僵菌等产生芽生孢子的丝孢类真菌的遗传操作，而且转化效率较高，易于操作。这种新的转化体系和陷阱技术相结合，将有助于促进杀虫真菌功能基因的发掘和菌株改良。BCW15蛋白生物学功能验证采用反义RNA技术抑制基因的表达验证BCW15基因的生物学功能。构建含有BCW15基因反义RNA转录元件和筛选标记bar基因的反义质粒pAN52-antiBCW15-Bar。利用REMI技术和芽生孢子转化体系，将反义质粒插入球孢白僵菌基因组DNA中。随机选取5个插入反义质粒的转化子培养至产孢，所获转化子分生孢子的FAE蛋白的含量均显著低于野生菌株及转化对照菌株之间差异极显著(F6，14=107.2，P＜0.01)。对FAE蛋白组分进行分析表明，BCW15蛋白在反义质粒转化子的孢子中未见表达，而其它两个主要组分的表达未见显著变化。这说明反义RNA技术是球孢白僵菌基因功能验证的有效工具，芽生孢子转化体系是有效的转化载体。转化子分生孢子在48℃胁迫30 min后的残存指数与野生菌株和转化对照菌株之间存在显著差异(F6，14=20.6，P＜0.05)。野生菌株残存指数均为0.66，与转化对照菌株差异不显著，五个反义转化子的平均残存指数为0.47（0.38～0.55）。转化子A1、野生菌株和转化对照菌株的残存指数随胁迫时间衰变的过程均很好地拟合逻辑斯蒂方程（r2≥0.98，P＜0.01）。根据所拟合各菌株的议程，野生菌株、转化对照菌株和转化子A1的LT50分别为41.1、40.4和31.9 min。显然，反义质粒转化子的LT50下降了约10 min。由此证明，孢壁蛋白BCW15的缺失无碍孢子产生和萌发，但显著降低孢子耐热力。金属硫蛋白的异源表达及其生物学功能将粗糙脉孢霉金属硫蛋白基因导入球孢白僵菌，以评价该蛋白是否具有保护孢子免受热胁迫损伤的功能。先构建含有金属硫蛋白基因MT和筛选标记bar基因的双元质粒pAN52-MT-Bar，再将此双元质粒经芽生孢子转化体系介导转入球孢白僵菌基因组DNA中。结果显示，转化子菌丝的巯基含量均显著高于野生菌株和对照质粒pAN52-Bar转化的菌株(F6，14=14.52，P＜0.01)。选取3个巯基含量高的转化子，Western杂交显示MT蛋白在转化子中被高效表达。三个转化子的分生孢子在48℃下胁迫30 min后的平均残存指数为0.74（0.71-0.76），显著高于野生菌株CK的0.66和对照转化菌株TCK的0.68(F4，10=8.4，P＜0.05)。将胁迫时间延长，菌株CK、TCK和转化子M4（胁迫30 min后的残存指数在3个转化子中居中）的残存指数随时间的衰变过程均很好地拟合逻辑斯蒂方程（r2≥0.98，P＜0.01），同此估计获得菌株CK、TCK和M4的LT50分别为41.1、40.4和45.8 min。这表明重组金属硫蛋白的球孢白僵菌分生孢子的LT50延长了约5.0 min，即耐热力显著增强。硫氧还蛋白的异源表达及其生物学功能将大肠杆菌thxA基因导入球孢白僵菌中，以考察原核生物基因在球孢白僵菌中表达的可能性，并评价其保护孢子免受热损伤的潜在作用。先构建含有thxA基因和筛选标记bar基因的双元质粒pAN52-THX-Bar，将其经芽生孢子转化体系介导转入球孢白僵菌基因组DNA中。不同转化子菌体内硫氧还蛋白的比活力存在显著差异(F6，14=142.9，P＜0.01)，野生菌株CK和对照转化菌株TCK的比活力几乎为零。选取3个高比活力的转化子T1、T3和T5，Western杂交分析显示硫氧还蛋白在转化子中被高效表达。三个转化子分生孢子在48℃下胁迫30 min后的平均残存指数为0.78（0.76-0.81），显著高于菌株CK的0.66和了CK的0.68(F4，10=17.1，P＜0.01)，而后二者之间差异不显著。将48℃下的胁迫时间延长，菌株CK、TCK和转化子T1的残存指数的衰变过程拟合Logistic方程（r2≥0.98，P＜0.01），菌株CK、TCK和T1的LT50分别为41.1、40.4和49.2 min。这表明重组硫氧还蛋白使球孢白僵菌孢子的LT50延长了约8.0 min，即重组后分生孢子的耐热力显著增强。综上所述，本研究的主要结果，一是建立了杀虫真菌分生孢子耐热性测定的技术方法和定量评价体系，改进了孢子中可甲酸抽提（FAE）蛋白的提取方法，探明了影响孢子耐热力和FAE蛋白积累的因素。二是发现了参与孢子耐热性状的几种孢壁FAE蛋白，并据此提出了新的生物学假说。三是首次克隆了一个球孢白僵菌孢子耐热力相关的FAE蛋白的基因，并确切证明了它对孢子耐热力的功能及贡献，同时基本证明了假说的成立。四是首创了全新的球孢白僵菌芽生孢子的遗传转化体系，并成功地用于异源抗逆功能基因的重组菌株构建，使重组菌株的耐热力得到显著提高。所有这些研究结果都将有助于增进对丝孢类生防真菌抗逆生物学基础的认识，有助于推动杀虫真菌侵染生物学、流行学和剂型生物学的研究不断深入，有助于提升真菌杀虫剂或其它生防真菌制剂的田间适应性和科技含量。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 丝孢类生防真菌的剂型生物学、胁迫生物学及遗传操作
• 1.1 丝孢类生防真菌的剂型生物学
• 1.2 生防真菌的热胁迫生物学
• 1.3 真菌细胞壁组成
• 1.4 真菌胞壁疏水蛋白
• 1.5 杀虫真菌的基因工程
• 1.5.1 丝孢类真菌基因功能分析
• 1.5.2 杀虫真菌的遗传转化
• 1.5.3 杀虫真菌的遗传改造
• 1.6 展望
• 2 球孢白僵菌分生孢子耐热生物学及其类疏水蛋白
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 气生分生孢子固液双相法制备
• 2.2.2 孢子耐热力与类疏水蛋白的影响因子
• 2.2.3 分生孢子耐热力测定
• 2.2.4 类疏水蛋白提取与测定
• 2.2.5 类疏水蛋白电泳分析
• 2.2.6 孢子金属元素含量测定
• 2.2.7 数据分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同菌株孢子的耐热力
• 2.3.2 不同菌株孢子的类疏水蛋白含量
• 2.3.3 不同菌株类疏水蛋白的组分分析
• 2.3.4 培养条件对孢子耐热力的影响
• 2.3.5 培养条件对孢壁类疏水蛋白含量的影响
• 2.3.6 培养条件对孢子FAE蛋白组分的影响
• 2.3.7 孢子中金属离子的积累
• 2.3.8 孢子耐热力与FAE蛋白含量的关联
• 2.4 讨论
• 3 耐热相关类疏水蛋白的基因克隆与分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 蛋白纯化
• 3.2.2 蛋白的电转印及检测
• 3.2.3 蛋白的N-端序列测定
• 3.2.4 BCW15蛋白编码序列的3′-RACE扩增
• 3.2.5 扩增BCW15蛋白基因上游序列
• 3.2.6 BCW15基因的Southern杂交分析
• 3.2.7 不同菌株BCW15基因克隆与比较分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 BCW15蛋白的纯化
• 3.3.2 BCW15蛋白的氮端序列测定
• 3.3.3 基因BCW15的克隆与序列分析
• 3.3.4 基因BCW15的Southern杂交分析
• 3.3.5 不同菌株的BCW15克隆与比较
• 3.4 讨论
• 4 基于芽生孢子的球孢白僵菌遗传转化体系构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 确定草丁膦的抑制浓度
• 4.2.2 构建双元质粒
• 4.2.3 感受态芽生孢子的制备
• 4.2.4 芽生孢子转化过程
• 4.2.5 转化子稳定性测试
• 4.2.6 转化子鉴定
• 4.2.7 构建Ploy A陷阱载体及转化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 芽生孢子转化的质粒制备
• 4.3.2 基因bar和exfp的表达
• 4.3.3 Ploy A陷阱载体构建、转化与鉴定
• 4.4 讨论
• 5 BCW15蛋白生物学功能验证
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株与质粒
• 5.1.2 试剂
• 5.2 方法
• 5.2.1 构建BCW15基因反义质粒
• 5.2.2 质粒转化
• 5.2.3 转化子鉴定
• 5.2.4 BCW15蛋白表达的检测
• 5.2.5 测定孢子的耐热力
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 反义质粒构建与转化
• 5.3.2 转化子鉴定
• 5.3.3 BCW15蛋白的表达
• 5.3.4 孢子的耐热力
• 5.4 讨论
• 6 基于球孢白僵菌芽生孢子转化的异源金属硫蛋白表达及功能
• 6.1 材料
• 6.1.1 菌株与质粒
• 6.1.2 试剂
• 6.2 方法
• 6.2.1 构建金属硫蛋白基因表达质粒
• 6.2.2 质粒转化
• 6.2.3 总巯基含量测定
• 6.2.4 Western免疫印迹检测
• 6.2.5 转化子鉴定
• 6.2.6 测定孢子的耐热力
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 MT表达质粒构建与转化
• 6.3.2 总巯基含量测定
• 6.3.3 金属硫蛋白的表达
• 6.3.4 转化子鉴定
• 6.3.5 孢子的耐热力
• 6.4 讨论
• 7 基于球孢白僵菌芽生孢子转化的异源硫氧还蛋白表达及功能
• 7.1 材料
• 7.1.1 菌株与质粒
• 7.1.2 试剂
• 7.2 方法
• 7.2.1 构建金属硫蛋白基因表达质粒
• 7.2.2 质粒转化
• 7.2.3 硫氧还蛋白活性测定
• 7.2.4 Western免疫印迹检测
• 7.2.5 转化子鉴定
• 7.2.6 转化子孢子耐热力的测定
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 thxA表达质粒构建与转化
• 7.3.2 硫氧还蛋白活力测定
• 7.3.3 硫氧还蛋白的表达
• 7.3.4 转化子鉴定
• 7.3.5 孢子的耐热力
• 7.4 讨论
• 8 结语
• 参考文献
• Summary
• 附件:攻读学位期间的主要成果