多功能蛋白p62在人卵巢癌细胞耐药中的作用及其机制的研究

论文摘要

卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤之一,术后常规治疗方案是在细胞减灭术的基础上进行以顺铂为主的联合化疗。顺铂是广泛使用的化疗药物,但由于原发或继发的多药耐药的存在,严重影响了化疗的疗效及患者预后。已有研究表明,细胞顺铂耐药的形成与内质网应激有关。当细胞发生内质网应激时,错误折叠蛋白过量集聚,触发未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response,UPR）,除了经典的内质网相关蛋白降解（ER-associated protein degradation,ERAD）途径参与降解错误折叠蛋白以外,还可激活另一细胞降解途径-----内质网激活的自噬（ER-activated autophagy,ERAA）途径。p62,一个多功能蛋白,研究发现p62在启动细胞存活信号,包括增殖,分化和抗凋亡基因诱导方面发挥功能,并且在多种肿瘤异常表达。p62的N端有一个Phox和Bem1p（PB1）区,能够促其自身寡聚化及多聚化;C端包含一个ubiquitin-associated（UBA）区,使其能与泛素化蛋白相互作用。p62可与泛素化错误折叠蛋白结合,依赖与LC3/GABARAP家族蛋白经自噬途径降解,因此,有人认为p62作为各种泛素化底物选择性自噬的衔接受体,参与了细胞内环境稳定的调控,维持细胞的存活。已有研究表明,Keap1-Nrf2通路通过激活下游抗氧化基因的表达促进肿瘤细胞耐药。p62可以调节Keap1-Nrf2-ARE信号途径,p62可同Nrf2竞争性结合Keap1,使Nrf2转化入核,从而激活Nrf2的靶基因转录。亦有研究认为p62的KIR结构域可以直接与Keap1的Kelch重复结构域结合,因此阻断了Keap1和Nrf2的结合,使Keap1经自噬途径降解,Nrf2被激活,从而促进下游抗氧化反应性元件ARE的转录,保护细胞免受氧化性损伤。可见,多功能蛋白p62有可能参与自噬途径和/或通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号途径参与肿瘤细胞耐药。本实验以人卵巢癌细胞株SKOV3及其顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP为研究对象,以多功能蛋白p62为靶点,探讨其在人卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用及其机制,为肿瘤耐药的临床治疗提供新的方向。方法（1）根据p62的基因序列（GenBank:NM003900）以及RNAi设计原理,构建pGCsilencerTM U6/Neo/GFP/RNAi载体,命名质粒为si-p62,并通过DNA测序、RT-PCR、Western blot等技术进行验证。（2） MTT法检测细胞生存率;Hoechst 33258染色观察细胞核形态;Western blot分析细胞内质网应激相关蛋白Grp78、GADD153、Cleaved Caspase-4、泛素化蛋白Ub及Cleaved Caspase-3等蛋白的表达。（3） RT-PCR和Western blot方法检测细胞中p62 mRNA及蛋白水平表达;间接免疫荧光技术检测p62与LC3共定位;透射电镜观察细胞超微结构;Western blot分析细胞LC3-II表达。（4）利用3-MA和LAC分别抑制自噬和蛋白酶体途径,观察细胞生存率的同时,Western Blot分析细胞内质网应激相关蛋白Grp78、GADD153、Cleaved Caspase-4和泛素化蛋白Ub的表达。（5） si-p62抑制p62表达,MTT法检测细胞生存率;Western blot分析细胞内质网应激相关蛋白Grp78、GADD153、Cleaved Caspase-4和泛素化蛋白Ub的表达;Hoechst 33258染色观察细胞核形态;流式细胞术检测细胞凋亡率。（6）利用H2O2制作人卵巢癌细胞氧化损伤模型,MTT检测细胞生存率;DCFH-DA检测人卵巢癌细胞ROS水平;Hoechst 33258染色观察细胞核形态;Western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白的表达。（7）间接免疫荧光技术检测p62与Keap1共定位;Western blot方法检测Keap1、Nrf2表达;RT-PCR检测GSTP1、ALDH1A7 mRNA表达。结果1.与SKOV3/DDP细胞相比,SKOV3细胞对顺铂更敏感;顺铂可以诱导SKOV3细胞泛素化蛋白Ub和内质网应激相关蛋白Grp78、GADD153、Cleaved Caspase-4表达上调,细胞发生凋亡;同等浓度的顺铂不影响SKOV3/DDP细胞相关蛋白表达,极个别细胞发生凋亡。2.相对于SKOV3细胞中不表达p62,而SKOV3/DDP细胞p62无论蛋白还是mRNA水平均呈高表达,顺铂诱导SKOV3/DDP细胞中p62蛋白表达逐渐降低。3.顺铂能够引起p62与LC3发生大量的点状聚集并且形成共定位,提示顺铂诱导SKOV3/DDP细胞发生自噬。4.自噬抑制剂3-MA抑制SKOV3/DDP细胞自噬,可以引起p62、泛素化蛋白、内质网应激相关蛋白、凋亡蛋白表达上调;而LAC抑制蛋白酶体途径,泛素化蛋白略有增多,p62、内质网应激相关蛋白、凋亡蛋白表达却未见明显变化,提示p62主要结合泛素化蛋白经自噬途径降解。5.构建si-p62重组质粒并转染SKOV3/DDP细胞,抑制p62表达,能够提高SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性,细胞泛素化蛋白、内质网应激相关蛋白、凋亡蛋白表达上调,细胞的凋亡率增高。6.相对于SKOV3/DDP细胞,顺铂和H2O2能够诱导SKOV3细胞产生大量的活性氧ROS。7. H2O2对SKOV3/DDP细胞p62的mRNA水平没有影响,却引起p62蛋白水平逐渐降低;并引起SKOV3/DDP细胞p62形成点状聚集;Keap1蛋白表达下调,核内Nrf2蛋白表达上调;抗氧化基因GSTP1、ALDH1A7表达上调。提示H2O2激活SKOV3/DDP细胞Keap1-Nrf2-ARE信号途径。8.抑制p62表达,SKOV3/DDP细胞对H2O2的敏感性增强;细胞中抗氧化基因GSTP1、ALDH1A7表达相对下调,细胞的凋亡率提高。提示p62可能参与调控Keap1-Nrf2-ARE信号途径。结论本实验以人卵巢癌细胞株SKOV3及其顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP为研究对象,发现SKOV3细胞中p62不表达,顺铂诱导其发生内质网应激介导的凋亡,而SKOV3/DDP细胞p62高表达,同等浓度顺铂不能诱导其发生内质网应激介导凋亡,提示p62可能与人卵巢癌细胞耐药有关;进一步的研究发现随着顺铂作用时间延长,SKOV3/DDP细胞中p62 mRNA表达水平保持不变,蛋白表达水平逐渐降低,提示顺铂对p62的影响不是在转录水平而是在蛋白水平,p62蛋白可能被降解;利用多种实验技术研究发现顺铂可诱导SKOV3/DDP细胞自噬发生,并且p62能够与泛素化蛋白结合经自噬途径被降解,缓解了SKOV3/DDP细胞内质网应激;提示经自噬途径降解泛素化蛋白,减轻内质网应激可能是SKOV3/DDP细胞耐药的机制之一。同时,相对于SKOV3/DDP细胞,顺铂能够诱导SKOV3细胞产生大量ROS;而利用H2O2作用SKOV3/DDP细胞,引起p62大量点状聚集,Keap1-Nrf2-ARE信号途径激活,细胞抗氧化基因表达上调,细胞ROS水平降低;抑制p62的表达,SKOV3/DDP细胞中抗氧化基因表达相对下调,细胞凋亡率增高;提示p62调控的Keap1-Nrf2-ARE信号通路可能参与SKOV3/DDP细胞耐药。本实验首次探讨了多功能蛋白p62在人卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用。其作用机制:一方面,p62通过结合泛素化蛋白通过自噬途径降解,缓解细胞内质网应激,维持细胞内环境稳定;另一方面,p62可能通过调控Keap1-Nrf2-ARE信号途径,激活细胞内抗氧化基因的表达,降低了细胞ROS水平,导致细胞耐药的形成。因此,我们认为p62作为一个多功能蛋白,可能从多角度、多层面上调控人卵巢癌细胞顺铂耐药,进一步研究p62的作用机制,有可能为人卵巢癌顺铂耐药的治疗提供一条新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 卵巢癌耐药的研究进展
• 1.1.1 卵巢癌发病情况
• 1.1.2 卵巢癌治疗情况
• 1.2 多功能蛋白p62 的研究进展
• 1.2.1 p62 的结构
• 1.2.2 p62 参与细胞自噬
• 1.2.3 p62 参与调控细胞信号途径
• 第二章 实验部分
• 2.1 多功能蛋白p62 经自噬途径降解泛素化蛋白参与卵巢癌细胞顺铂耐药机制的研究
• 2.1.1 前言
• 2.1.2 材料和方法
• 2.1.3 实验结果
• 2.1.4 讨论
• 2.1.5 小结
• 2.2 多功能蛋白p62 通过影响Keap1-Nrf2-ARE 细胞信号途径提高SKOV3/DDP 细胞的抗氧化能力的研究
• 2.2.1 前言
• 2.2.2 材料和方法
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.4 讨论
• 2.2.5 小结
• 第三章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢