几种高温浸矿菌的分离鉴定及其应用基础与浸矿潜力研究

论文摘要

本论文根据不同高温环境样品的理化性质和目标菌株的生理生化特性,对不同温度级的高温浸矿菌进行了系统的富集、分离和鉴定,并对所分离的高温浸矿菌株进行了应用基础和浸矿潜力研究,以期为我国高温浸矿菌种资源库的建立提供菌种资源,为高温浸矿菌的基础和应用研究提供优良出发菌株。作者从我国不同地域采集到各种环境样品14份,共从中分离鉴定出各类高温菌6属6种30余株,包括喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacilluscaldus）21株（最适生长温度35-55℃）、嗜热硫氧化硫化杆菌（Sulfobacillus thermosulfidooxidnas）1株（最适生长温度53℃）、仙台脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus sendaiensis）1株（最适生长温度55℃）、万座酸菌（Acidianus manzaensis）2株（最适生长温度65℃）、金属硫叶菌（Sulfolobus metallicus）2株（最适生长温度67℃）和勤奋金属球菌（Metallosphaera sedula）3株（最适生长温度66.5℃）。在所有分离鉴定的高温菌中,除仙台脂环酸芽孢杆菌外,其它菌株均具有浸矿功能。由于篇幅所限,本论文只涉及到其中的前四属四种,即喜温嗜酸硫杆菌、嗜热硫氧化硫化杆菌、仙台脂环酸芽孢杆菌和万座酸菌。本论文对上述四种高温菌的研究主要包括如下内容。1)喜温嗜酸硫杆菌的分离鉴定使用多种培养基,采用琼脂平板固体分离法从样品中分离到喜温嗜酸菌21株。经形态特征、生理生化特性研究及16S rRNA基因序列分析,鉴定这21个菌株为喜温嗜酸硫杆菌。根据样品来源,将这些菌株分为5个系列,即“YN”系列（来自云南腾冲、新华、瑞甸酸性热泉）,“AN”系列（来自云南安宁酸性温泉）,“TW”系列（来自台湾阳明山酸性热泉）,“JX”和“DB”系列（分别来自江西德兴、广东大宝山酸性矿山废水）。2)喜温嗜酸硫杆菌菌株随机扩增DNA多态性分析21株喜温嗜酸硫杆菌来自多个地理位置相互隔离,物理化学性质各异的环境样品,虽然同属一种,但有些菌株在生理生化特性上表现出较大的差异。为揭示这些菌株之间的亲缘关系以及菌株差异性和环境条件之间的关联,从而为高效浸矿菌株的选育提供理论依据,作者在国内外首次运用随机扩增DNA多态性（RAPD）技术对这些菌株进行了多态性分析。结果表明这21个菌株可以分成三组,菌株分异主要与栖息环境的化学特性有关。硫、铁、铜、铝、钨、锌、镁、锰是影响菌群分异的主要因素,其中硫是关键元素。3)喜温嗜酸硫杆菌菌株的重金属抗性研究国内外有关喜温嗜酸硫杆菌对有毒离子的抗性研究多集中于砷。有关喜温嗜酸硫杆菌对其它有毒离子,特别是重金属离子抗性的研究报道较少。研究喜温嗜酸硫杆菌对重金属离子的抗性,对于提高其浸矿效率具有十分重要的意义。作者根据喜温嗜酸硫杆菌菌株的来源,选择了10个菌株和5种重金属硫酸盐,对所选菌株进行了重金属抗性研究。结果显示,YN12菌株对Zn2+、Cd2+和Co2+的初始耐受浓度最高,对YN12的抗Cd2+能力进行进一步的驯化增强后,其最终Cd2+耐受浓度达到罕见的210 g·L-13CdSO4·8H2O(相当于31.5g·L-1Cd2+),是目前所报道的抗Cd2+能力最强的菌株;DB2菌株对Cu2+的初始耐受浓度最高;而YN2对Ni2+的初始耐受能力最强。4)嗜热硫氧化硫化杆菌的分离鉴定根据嗜热硫氧化硫化杆菌能产生内生孢子,以抵抗不利环境的特点,本文作者采用前期以该菌的最适生长条件促进其营养生长,后期以该菌的临界生长条件促进其孢子生成的方式对该菌进行富集,最后采用促进营养生长的方式对该菌进行稀释分离,成功地从取自云南,pH4.5、温度约60℃的酸性热泉水样中分离到一株最适生长温度53℃,最适生长pH1.5(Fe2+培养基)或2.5（S0培养基）的杆状细菌YN22。经形态学、生理生化、分子生物学等方面的详细研究,确认YN22属于嗜热硫氧化硫化杆菌。这是国内首次分离,并经多种方法鉴定、确认的嗜热硫氧化硫化杆菌。5)嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株作用下形成的铁矾沉淀及其对该菌的影响为了解嗜热硫氧化硫化杆菌作用下铁矾沉淀形成的规律以及铁矾沉淀对该菌生长的影响,从而为该菌浸矿参数的优化提供理论依据,作者在该菌最适生长条件下,在加或不加玻璃珠的培养基中,得到铁矾沉淀。加玻璃珠和不加玻璃珠两组间在Fe2+氧化速率、沉淀产量和菌群密度上有显著差异,加玻璃珠一组Fe2+氧化速率快6h,沉淀出现时间早6h,沉淀产量高78%。X衍射图谱、红外吸收光谱、能谱和扫描电镜图像揭示这两种沉淀都是黄钾铁矾和黄铵铁矾的混合物,形态上与后者相似。在未接种的加玻璃珠和不加玻璃珠对照组中,实验期间均无沉淀生成。产自不加玻璃珠组的沉淀对YN22菌株的生长和Fe2+氧化能力没有明显影响,而产自加玻璃珠组的沉淀在浓度达到4g·L-1时就会对YN22菌株的生长和Fe2+氧化能力造成明显的抑制作用。实验结果提示,YN22用于实际浸矿,特别是用于搅拌式槽浸时,为防止铁矾沉淀的过早出现和过度累积,在其它参数较难调控的情况下,应将浸矿体系的pH控制在较低的合适范围内。6)嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出到目前为止,国内尚未见嗜热硫氧化硫化杆菌浸出黄铜矿的报道。为评估其浸矿潜力,作者研究了YN22菌株纯菌以及和喜温嗜酸硫杆菌混合对黄铜矿和黄铁矿的浸出。结果显示,YN22菌株单独浸出黄铜矿的效率较低,25d铜的浸出率为14.7%。当YN22菌株与适度嗜热硫氧化菌—喜温嗜酸硫杆菌YN2菌株混合,浸矿效率大大改善,同期铜的浸出率提高到46.2%。YN22菌株对黄铁矿的浸出效果较好,经过25d的浸出,纯菌浸出液中总铁浓度达到5292 mg·L-1,是无菌浸出液的4.73倍。研究结果提示,用YN22菌株浸出黄铜矿一类的原生硫化矿时,最好与适度嗜热硫氧化菌混合。7)异养菌YNTC-1的分离鉴定及其对YN22菌株浸矿的影响为了解共栖异养菌对嗜热硫氧化硫化杆菌浸矿的影响,从分离YN22菌株的富集物中分离鉴定了一株与YN22共栖的专性异养菌YNTC-1,并利用该菌与YN22混合,进行了黄铜矿和黄铁矿的浸矿试验。基于表型、基因型和系统发育分析结果,YNTC-1菌株被鉴定为仙台脂环酸芽孢杆菌一新菌株。用YN22纯菌以及YN22与YNTC-1混合菌对黄铜矿和黄铁矿进行的浸矿实验表明,YNTC-1菌株对这两种硫化矿的浸出没有明显的促进作用。8)万座酸菌的分离鉴定运用原位富集法对云南腾冲的酸性热泉水样进行富集后,在实验室成功分离纯化了2株嗜热喜酸菌—YN25、YN26。经多种方法详细鉴定,确认两个菌株属于嗜热古菌—万座酸菌。万座酸菌是新近发现的酸菌属新种,目前全世界仅有3个菌株,即模式菌株NA-1T和我们自云南酸性热泉中分离的YN25和YN26两个菌株。YN25和YN26是国内首次分离鉴定的万座酸菌菌株,该研究成果对于推动我国浸矿菌种,特别是高温浸矿菌种的基础和应用研究具有重要意义。9)万座酸菌YN25菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出万座酸菌YN25菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出实验表明,该菌株是目前已报道的浸矿菌中浸矿能力最强的菌株之一。黄铜矿的摇瓶实验结果显示,24d铜的浸出率达到79.16%。对黄铜矿的继代浸出实验进一步表明,通过Cu2+定向驯化,YN25菌株对Cu2+的耐受浓度可以在首次浸矿的基础上提高80%以上。YN25菌株对黄铁矿的浸出能力也远远高于YN22菌株,经过28d,YN25浸出液中Fetot浓度是YN22的3.4倍。这是目前国内外首次进行的万座酸菌浸矿实验,是该菌的重要应用基础研究,对于评价其应用前景具有重要的指导意义。

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摘要

ABSTRACT

第一章前言

1.1 高温浸矿菌的定义与种类

1.1.1 高温浸矿菌的定义

1.1.2 高温浸矿菌的种类

1.2 高温浸矿菌在微生物冶金中的作用与地位

1.2.1 高温浸矿菌的高效性

1.2.2 高温浸矿菌的工业应用

1.3 高温浸矿菌分布的局限性

1.4 本论文的研究目的与意义

1.5 本论文的主要研究内容

1.6 本论文的课题来源

第二章喜温嗜酸硫杆菌（Acidithiobacillus caldus）的分离鉴定

2.1 材料与方法

2.1.1 样品采集

2.1.2 菌株富集

2.1.3 菌株分离

2.1.4 16S rRNA基因分析

2.1.5 菌株形态特征研究

2.1.6 菌株生理生化特性研究

2.2 结果与讨论

2.2.1 菌株的形态特征

2.2.2 菌株生理生化特性

2.2.3 菌株16S rDNA序列的同源性比较

2.3 鉴定结论

2.4 本章小结

第三章喜温嗜酸硫杆菌菌株随机扩增DNA多态性分析

3.1 材料与方法

3.1.1 实验用菌株

3.1.2 DNA提取与扩增

3.1.3 数据分析

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 本章小结

第四章喜温嗜酸硫杆菌菌株的重金属抗性研究

4.1 材料与方法

4.1.1 重金属最高初始耐受浓度试验

4.1.2 YN12菌株抗镉性能驯化试验

4.2 结果与讨论

4.2.1 各菌株的重金属最高初始耐受浓度

4.2.2 YN12菌株抗镉性能驯化

4.3 本章小结

第五章嗜热硫氧化硫化杆菌（Sulfobacillus thermosulfidooxidans）的分离鉴定

5.1 材料与方法

5.1.1 菌种分离策略与步骤

5.1.2 菌种鉴定

5.2 结果与讨论

5.2.1 形态特征与生理生化特性

5.2.2 基于16S rDNA序列的系统发育分析

5.2.3 基因组DNA的G+C含量

5.3 鉴定结论

5.4 本章小结

第六章嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株作用下形成的铁矾沉淀及其对该菌的影响

6.1 材料与方法

6.1.1 菌种和材料

6.1.2 分析方法

6.2 结果和讨论

6.2.1 铁矾沉淀分析

6.2.2 铁矾沉淀进程

6.2.3 铁矾沉淀对YN22菌株的影响

6.3 结论

6.4 本章小结

第七章嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出

7.1 材料与方法

7.1.1 菌种和矿物

7.1.2 实验方法

7.2 结果与讨论

7.2.1 黄铜矿的浸出

7.2.2 黄铁矿的浸出

7.3 本章小结

第八章异养菌YNTC-1的分离鉴定及其对嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株浸矿的影响

8.1 材料与方法

8.1.1 异养菌YNTC-1的分离

8.1.2 异养菌YNTC-1的鉴定

8.1.3 黄铁矿和黄铜矿的生物浸出

8.2 结果与讨论

8.2.1 菌株鉴定

8.2.2 YNTC-1对YN22浸矿的影响

8.3 本章小结

第九章万座酸菌（Acidianus manzaensis）的分离鉴定

9.1 材料与方法

9.1.1 菌种原位富集

9.1.2 菌种稀释分离

9.1.3 菌种鉴定

9.2 结果与讨论

9.2.1 基于16S rRNA基因的系统发育

9.2.2 形态特征

9.2.3 营养类型

9.2.4 厌氧代谢

9.2.5 抗生素敏感性和重金属抗性

9.2.6 最适生长条件和生长曲线

9.2.7 细胞膜脂肪酸成分

9.3 鉴定结论

9.4 本章小结

第十章万座酸菌YN25菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出

10.1 材料与方法

10.2 结果与讨论

10.2.1 黄铜矿浸矿实验

10.2.2 黄铁矿浸矿实验

10.3 本章小结

第十一章结论

1) 喜温嗜酸硫杆菌的分离鉴定

2) 喜温嗜酸硫杆菌菌株随机扩增DNA多态性分析

3) 喜温嗜酸硫杆菌菌株的重金属抗性研究

4) 嗜热硫氧化硫化杆菌的分离鉴定

5) 嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株作用下形成的铁矾沉淀及其对该菌的影响

6) 嗜热硫氧化硫化杆菌YN22菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出

7) 异养菌YNTC-1的分离鉴定及其对YN22菌株浸矿的影响

8) 万座酸菌的分离鉴定

9) 万座酸菌YN25菌株对黄铜矿和黄铁矿的浸出

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文及研究成果

几种高温浸矿菌的分离鉴定及其应用基础与浸矿潜力研究

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