嗜酸氧化亚铁硫杆菌中四个ABC transporter基因的鉴定与分析

论文摘要

作为一种重要的浸矿菌种,嗜酸氧化亚铁硫杆菌对于很多重金属离子都具有较高的抗性。研究清楚这种在极端环境下生长的细菌的抗性机理,对于提高微生物的浸矿能力,改良和优化微生物冶金工艺具有重要的理论和实践意义。本文探究了嗜酸氧化亚铁硫杆菌DC对于不同种类的重金属离子（Ni2+.Mn2+.Al3+.Zn2+.Cd2+）的耐受能力,并首次克隆鉴定了DC菌中与金属离子转运密切相关的四个相连的catiOn ATP-binding cassette（ABC）transpoIrter基因。然后应用实时荧光定量PCR技术检测了不同浓度的锌离子刺激时四个基因在转录水平上的差异表达情况,并应用逆转录PCR技术鉴定了四个基因的共转录情况。最后利用生物信息学分析技术对四个基因及其编码的蛋白做了进一步的结构与功能的预测。实验结果如下：At.ferrooxidans DC对Ni2+的最大耐受能力为0.7 mol/L,对Mn2+和Al3+的最大耐受能力为0.4 mol/L,对Zn2+最大耐受能力为0.6 mol/L,Cd2+为0.75 mol/L.经NCBI序列比对,At.ferrooxidans DC中与重金属离子转运相关的四个cation ABC transporter基因（Afe2435,Aye2436,Afe2437, Afe2438）的基因序列与标准菌株ATCC23270中这四个基因的序列完全相同。基因Aye2435,Aye2436,Aye2437,Afe2438对于锌离子的胁迫非常敏感,具体表现为：在不同浓度的锌离子刺激下,四个基因在转录水平上的表达量均呈上调趋势,且随着锌离子浓度的增加,上调倍数也随之增加。共转录鉴定结果为：在At.ferrooxidans DC中,基因Afe2435, Afe2436,Afe2437,Afe2438存在共转录现象,他们很可能存在于同一个转录元件中。生物信息学分析结果表明：基因Afe2435,Afe2436编码的位于细胞质膜上的透性酶,基因Afe2437编码位于细胞质膜上的ATP结合蛋白,基因Afe2438编码周质空间上的锌离子结合蛋白。综上所述,At.ferrooxidans DC中的这四个cation ATP-binding cassette（ABC）transporter基因（Afe2435,Afe2436,Afe2437,Afe2438）共同组成了一个转运锌离子的ABC转运子,它们对于At. ferrooxidans DC能够耐受较高浓度的锌离子环境起到了非常重要的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物冶金进展的现状与前景
• 1.1.1 生物冶金的概念及优缺点
• 1.1.2 冶金微生物及其作用机理
• 1.1.3 国内外研究现状
• 1.1.4 生物冶金的前景与挑战
• 1.2 菌种抗性的机理
• 1.2.1 微生物抗重金属的机理概述
• 1.2.2 锌离子抗性机制
• 1.3 实时荧光定量PCR技术
• 1.3.1 实时荧光定量PCR的原理
• 1.3.2 实时荧光定量PCR的分类
• 1.3.3 内参基因的确定
• 1.4 本文的研究目的与研究内容
• 1.4.1 研究背景和依据
• 1.4.2 研究目的
• 1.4.3 研究内容
• 1.5 论文课题受资助的情况
• 第二章 At.ferrooxidans DC对5种重金属离子的耐受实验
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 供试菌株与培养基
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2+最大耐受能力'>2.3.1 At.ferrooxidans DC对Ni²⁺最大耐受能力
• 2+最大耐受能力'>2.3.2 At.ferrooxidans DC对Mn²⁺最大耐受能力
• 3+最大耐受能力'>2.3.3 At.ferrooxidans DC对Al³⁺最大耐受能力
• 2+最大耐受能力'>2.3.4 At.ferrooxidans DC对Zn²⁺最大耐受能力
• 2+最大耐受能力'>2.3.5 At.ferrooxidans DC对Cd²⁺最大耐受能力
• 2.4 本章小结
• 第三章 At.ferrooxidans DC中四个ABC transporter基因的克隆鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验步骤
• 3.2.3 DC菌种ABC transporter基因的序列分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 DC菌全基因组提取结果
• 3.3.2 四个ABC transporter基因的克隆测序结果
• 3.4 本章小结
• 第四章 应用RT-qPCR技术分析基因在不同锌离子环境下的差异表达
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验步骤
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 总RNA质量
• 4.3.2 内参基因评估结果
• 4.3.3 引物评估结果
• 4.3.4 标准曲线评估结果
• 2+刺激下相关基因的差异表达'>4.3.5 不同浓度Zn²⁺刺激下相关基因的差异表达
• 4.4 本章小结
• 第五章 At.ferrooxidans DC中Afe2435、Afe2436、Afe2437、Afe2438的共转录鉴定
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验步骤
• 5.2.3 PCR检测
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 第六章 生物信息学分析
• 6.1 引言
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 开放阅读框
• 6.2.2 蛋白质相关数据的计算
• 6.2.3 亚细胞结构定位
• 6.2.4 跨膜结构分析
• 6.2.5 保守区域预测
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 本章小结
• 第七章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果