家蝇ceropin基因在昆虫细胞中的表达

论文摘要

家蝇抗菌肽具有理化性质稳定、抗菌谱广、特异性强等特点,在当前许多抗生素产生抗药性、开发新型抗生素困难的形势下,对家蝇抗菌肽的研究在农业、医药、食品等领域具有重要的科学意义。由于抗菌肽在家蝇的正常组织中含量很少,分离纯化难度较大,而化学合成的成本又十分昂贵,因此通过基因工程技术来获得抗菌肽成为首选方法。本文利用大肠杆菌侵染家蝇三日龄幼虫,通过提取其总RNA,以cDNA为模板,扩增cecropin基因的带有信号肽的序列,将其克隆到pMD18-T载体上,经序列测定与GenBank中的cecropin基因一致,成功获得含有信号肽的开放阅读框（ORF为192bp）的pMD18-T-C。该载体为进一步将家蝇cecropin基因在不同的表达系统中表达奠定基础。采取了Bac to Bac表达系统,对cecropin基因进行重组表达,该系统具有高效表达、翻译后修饰、无内毒素污染等优势。将cecropin基因克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTA,将重组质粒pFastBacHTA-cec转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒Bacmid-cec。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞（Tn-581-4）,获得含cec基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,表达目的蛋白。SDS-PAGE分析和Western blot显示,目的蛋白成功表达。将cecropin基因亚克隆到果蝇的转座子载体P-因子,在脂质体Lipofectin介导作用下,将P-C-N和含有转座酶的Hepler转入果蝇S2细胞,进行瞬时表达,通过细胞RT-PCR的方法检测表明cecropin基因能够在果蝇S2细胞中表达,这一结果作为在转基因果蝇中表达cecropin基因的体外检测,同时确定了G418对S2细胞的最佳筛选浓度850μg/ml,为果蝇的S2细胞稳定表达家蝇cecropin基因提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 天然抗菌肽的研究进展
• 1.2.1 抗菌肽的分类
• 1.2.2 抗菌肽的活性
• 1.2.3 抗菌肽的应用前景
• 1.2.4 家蝇抗菌肽
• 1.2.5 用基因工程方法表达家蝇cecropin基因的研究现状
• 1.3 杆状病毒载体表达系统
• 1.3.1 昆虫杆状病毒表达系统的优缺点
• 1.3.2 Bac to Bac表达系统的原理
• 1.3.3 昆虫杆状病毒表达系统的发展
• 1.4 昆虫转座子介导的外源基因的表达
• 1.4.1 昆虫转座子
• 1.4.2 介导外源基因的表达
• 1.5 研究内容
• 1.5.1 家蝇cecropin基因的克隆
• 1.5.2 家蝇cecropin基因在Tn细胞中的表达
• 1.5.3 P转座子介导的果蝇S2细胞中家蝇cecropin基因的表达
• 1.6 技术路线
• 1.7 研究目的和意义
• 1.8 研究创新点
• 第二章 家蝇cecropin基因的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 总RNA检测
• 2.2.2 家蝇cecropin基因克隆
• 2.2.3 家蝇cecropin基因序列分析
• 2.3 讨论
• 第三章 家蝇cecropin基因在Tn细胞中的表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果
• 18-T-cecl的酶切鉴定'>3.2.1 pMD₁₈-T-cecl的酶切鉴定
• 3.2.2 转移质粒pFastBac1HTA-cec酶切鉴定
• 3.2.3 重组Bacmid的获得
• 3.2.4 感染细胞的形态变化
• 3.2.5 Cecropin基因在昆虫细胞中的表达
• 3.3 讨论与展望
• 第四章 P转座子介导的果蝇S2细胞中家蝇cecropin基因的表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 试验结果
• 4.2.1 质粒P-C-N双酶切和PCR检测
• 4.2.2 G418对S2细胞的最佳抗性浓度
• 4.2.3 家蝇cecropin基因在S2细胞中的瞬时表达
• 4.3 讨论
• 第五章 小结与展望
• 5.1 小结
• 5.1.1 家蝇cecropin基因的克隆
• 5.1.2 家蝇cecropin基因在Tn细胞中的表达
• 5.1.3 P转座子介导的果蝇S2细胞中家蝇cecropin基因的表达
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录