红花籽粕中羟基肉桂酰血清素的分离及活性研究

论文摘要

我国的红花籽资源丰富,红花籽粕是红花籽制油时的副产物,一般作为动物饲料,附加值较低。羟基肉桂酰血清素类化合物是红花籽粕中的活性物质,研究表明,羟基肉桂酰血清素具有抗氧化、清除自由基、抑制肿瘤等多种生理功能。本文在前人研究的基础上,建立红花籽粕中羟基肉桂酰血清素检测方法、研究简单有效的分离纯化单体方法及各单体的体外生理活性。研究中首先建立了分析羟基肉桂酰血清素的反相高效液相色谱方法。羟基肉桂酰血清素四种单体阿魏酰血清素（FS）、N-（p-香豆酰）血清素（CS）、N-（p-香豆酰）色胺β-D-葡萄糖苷（CSG）、N-阿魏酰色胺β-D-葡萄糖苷（FSG）均在501800 ng/mL呈良好的线性相关,并在24h内有较好的稳定性,适用于红花籽粕中羟基肉桂酰血清素的检测。论文重点研究了大孔吸附树脂对四种单体的富集和纯化,以FS、CS为主要研究对象。对16种大孔树脂的静态吸附特性和解吸特征进行了研究。结果表明:XDA-1树脂对羟基肉桂酰血清素的吸附率和解吸率较高,适合于分离富集红花籽羟基肉桂酰血清素。研究了XDA-1树脂柱层析羟基肉桂酰血清素的动力学过程,优化确定了柱层析纯化工艺条件:柱床体积为20mL,CS、FS上样浓度分别为0.276mg/mL、0.346mg/mL,样品处理量;5倍柱体积,流速:6倍柱体积/时。层析前后CS、FS的含量分别从粗提物的1.63%、2.04%提高到为22.1%和24.7%,CSG和FSG的含量分别从粗提浸膏中的0.29%、0.23%提高到为3.28%和2.30%。在XDA-1树脂层析柱纯化基础上,采用C18层析柱、制备型HPLC层析柱进一步分离制备,得到四种羟基肉桂酰血清素单体。经HPLC-MS-DAD、1H-NMR、13C-NMR等检测方法,鉴定四种化合物分别为阿魏酰血清素（FS）、N-（p-香豆酰）血清素（CS）、N-（p-香豆酰）色胺β-D-葡萄糖苷（CSG）、N-阿魏酰色胺β-D-葡萄糖苷（FSG）。对四种单体进行体外清除自由基能力考察,四种单体对DPPH·、O2·-、·OH自由基的清除随其浓度的增加而增强,清除自由基能力强弱次序为CS>FS>FSG>CSG,且CSG、FSG清除自由基能力的浓度依赖关系远弱于FS、CS。体外抗肿瘤试验结果表明四种单体对肺癌细胞H446、肝癌细胞HepG-2、黑素瘤细胞B16具有较强的抑制癌细胞增殖的活性,且有明显的浓度依赖关系。其中FS、CS对肝癌细胞HepG-2的IC50分别为105.0μg/mL、173.2μg/mL;FS比CS有更高的抑制黑素瘤细胞B16增殖的活性,其IC50值为218.8μg/mL。两个糖苷衍生物CSG、FSG的肿瘤细胞增殖抑制作用较弱。羟基肉桂酰血清素具有较强的清除自由基、抗氧化和体外抗肿瘤作用,对于功能食品和新药的开发具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 红花籽及其粕概述
• 1.2 羟基肉桂酰血清素的研究进展和概况
• 1.2.1 羟基肉桂酰血清素的分布、存在及生物合成
• 1.2.2 羟基肉桂酰血清素的分析及纯化方法进展
• 1.2.3 羟基肉桂酰血清素及其类似物的生物活性
• 1.2.4 红花籽粕中羟基肉桂酰血清素的开发和应用前景
• 1.3 立题依据和意义
• 1.4 主要研究内容
• 第二章 羟基肉桂酰血清素反相高效液相色谱测定方法研究
• 2.1 试验材料与仪器
• 2.1.1 材料和试剂
• 2.1.2 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 样品的制备
• 2.2.2 羟基肉桂酰血清素的反相高效液相色谱分析
• 2.2.3 标准曲线和最低检测限的测定
• 2.2.4 分析系统考察
• 2.2.5 数据分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 羟基肉桂酰血清素的RP-HPLC分析系统研究
• 2.3.2 羟基肉桂酰血清素的RP-HPLC 分离系统方法学考察
• 2.4 本章小结
• 第三章 大孔树脂吸附羟基肉桂酰血清素的特性研究
• 3.1 试验材料与仪器
• 3.1.1 材料和试剂
• 3.1.2 仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 树脂的预处理和再生
• 3.2.2 静态吸附试验
• 3.2.3 动态吸附试验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 静态吸附试验
• 3.3.2 动态吸附试验
• 3.4 本章小结
• 第四章 羟基肉桂酰血清素单体结构鉴定
• 4.1 试验材料与仪器
• 4.1.1 材料和试剂
• 4.1.2 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 C18 层析柱纯化CS 和FS
• 4.2.2 制备柱纯化CSG 和FSG
• 4.2.3 HPLC-MS 检测
• 13C-NMR 检测'>4.2.4 1H-NMR 和¹³C-NMR 检测
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 柱层析分离纯化
• 4.3.2 结构鉴定
• 4.4 本章小结
• 第五章 羟基肉桂酰血清素抗氧化活性研究
• 5.1 试验材料与仪器
• 5.1.1 材料和试剂
• 5.1.2 仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 羟基肉桂酰血清素清除二苯代苦味肼基自由基活性的测定
• 5.2.2 羟基肉桂酰血清素清除羟自由基活性的测定
• 5.2.3 羟基肉桂酰血清素清除超氧阴离子自由基活性的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 羟基肉桂酰血清素清除DPPH·自由基活性
• 5.3.2 羟基肉桂酰血清素清除·OH 羟自由基
• ·-自由基的活性'>5.3.3 羟基肉桂酰血清素清除O2^·-自由基的活性
• 5.4 羟基肉桂酰血清素可能的抗氧化机理综合分析
• 5.5 本章小结
• 第六章 羟基肉桂酰血清素体外抗肿瘤活性研究
• 6.1 试验材料与仪器
• 6.1.1 材料和试剂
• 6.1.2 仪器
• 6.2 试验方法
• 6.2.1 完全培养液的配制
• 6.2.2 样品制备
• 6.2.3 肿瘤细胞体外培养
• 6.2.4 四唑盐比色法（MTT）原理与检测
• 6.2.5 实验数据处理
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 CS、FS对细胞增殖的抑制作用
• 6.3.2 CS、FS、CSG、FSG 对细胞增殖的抑制作用比较
• 6.4 本章小结
• 主要结论
• 问题与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录一：攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录二：核磁共振氢谱和碳谱