论文摘要
棉铃虫Helicoverpa armigera （Hiibner）是一种世界性的重要经济害虫。自20世纪八十年代以来,高效、低毒的拟除虫菊酯类杀虫剂被广泛用于防治棉铃虫。然而,由于杀虫剂频繁且不合理的使用,棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性水平逐年提高,并成为引起90年代初我国北方棉区棉铃虫大暴发的重要原因之一。抗性机理研究表明细胞色素P450氧化酶活性增强在棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性中起主要作用。NADPH-细胞色素P450还原酶（EC 1.6.2.4, NADPH-cytochrome P450 reductase,简称CPR）是细胞色素P450氧化还原酶系的重要组成部分,在细胞色素P450介导的氧化还原反应中起限速作用。本文采用RACE策略得到了棉铃虫CPR基因（HaCPR）的全长cDNA序列,研究了这个基因在棉铃虫体内的时空表达,并分别通过喂食和注射dsRNA两种方法干扰HaCPR基因的表达,观察HaCPR基因沉默后棉铃虫对杀虫剂的毒力、解毒代谢酶活力和生长发育的影响,以期为深入研究细胞色素P450酶系在棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性形成及棉铃虫的生长发育过程中的作用提供一定的理论基础。1.棉铃虫HaCPR基因的克隆与分析采用RT-PCR和RACE策略克隆出棉铃虫CPR基因HaCPR的全长cDNA序列（GenBank登录号为：HQ116527）。HaCPR基因的全长cDNA序列大小为2232bp,开放阅读框为2061bp,编码687个氨基酸,具有CPR蛋白的典型结构域,如FMN结合域、FMN连接域、FAD和NADPH结合域,保守氨基酸残基如Y149、Y187、Y467、Y489和W686。获得的棉铃虫CPR基因HaCPR与甘蓝夜蛾的CPR基因的相似性最高,为96%,与其它昆虫CPR的相似性为70%-89%。2.棉铃虫HaCPR基因的时空表达采用实时荧光定量PCR方法,比较了HaCPR基因在棉铃虫不同发育阶段及不同组织部位的表达情况。结果表明HaCPR基因在棉铃虫整个发育阶段及不同组织部位均有表达,卵期至幼虫期表达量逐渐升高,在3-4龄期达到最高,随后下降,蛹期降至最低,羽化后表达量再次升高。各时期的表达量分别为5龄期表达量的0.59（卵期）、1.46（1～2龄期）、1.54（3～4龄期）、0.26/0.19（雌蛹/雄蛹）和1.21/1.29（雌虫/雄虫）倍；HaCPR基因在棉铃虫5龄幼虫不同组织的表达分析结果表明,中肠部位表达量最高,脂肪体次之,头部最低,其表达量依次是整体表达量的3.61、1.29和1.08倍。3.棉铃虫HaCPR基因沉默后对杀虫剂毒力及代谢酶活力的影响通过喂食或注射的方式将HaCPR基因的dsRNA导入棉铃虫3龄或5龄幼虫体内,研究该基因沉默后对杀虫剂毒力及棉铃虫代谢酶活力的影响。敏感品系SCD、拟除虫菊酯抗性品系XJ和AY-R的3龄幼虫在喂食dsRNA（0.8μg/μl×2.5μ1）后,HaCPR基因的mRNA相对表达量与对照相比分别下降了49%（57%）、26%和23%。生物测定结果表明氰戊菊酯、溴氰菊酯和久效磷对三个品系处理组的毒力均有不同程度的下降,处理组与对照组间LC50比值为0.34～0.80,但在XJ和AY-R品系中,氰戊菊酯对处理组LC50的95%置信区间与对照组重叠。三种药剂单浓度下的死亡率T-test分析结果表明：（1）SCD品系,氰戊菊酯浓度为0.01mg/ml和0.02mg/ml时,处理组与对照组间的死亡率存在极显著差异；溴氰菊酯浓度为0.0025mg/ml时存在极显著差异。（2）XJ品系,氰戊菊酯浓度为0.08mg/m1时,处理组与对照组间的死亡率存在显著差异。（3）AY-R品系,氰戊菊酯浓度为25.6 mg/m1时,处理组与对照组间的死亡率存在显著差异。研究结果表明HaCPR基因的沉默能够在一定程度上增强棉铃虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性,而对久效磷类杀虫剂则无影响。AY-R品系1日龄5龄幼虫在注射dsRNA（14μg,10μl）进行基因沉默后,HaCPR基因在中肠和脂肪体中的mRNA相对表达量与注射缓冲液（10μ1）的对照组相比分别下降了12%和25%。酶活力测定结果表明处理组与对照组间的多功能氧化酶、谷胱甘肽-S-转移酶以及羧酸酯酶活力均无显著差异。4.Ha CPR基因沉默后对棉铃虫生长发育的影响通过喂食方式将HaCPR dsRNA导入SCD品系棉铃虫3龄幼虫体内,研究了HaCPR基因沉默后对棉铃虫生长发育的影响。SCD品系3龄幼虫在喂食dsRNA（0.8μg/μl×2.5μl）进行基因沉默后,HaCPR基因的mRNA相对表达量与对照组相比下降了49%。在基因沉默后幼虫的整个发育过程中,处理组与对照组的3龄和4龄幼虫历期无显著差异,但在5龄幼虫期和预蛹期存在极显著差异,即处理组历期明显长于对照组；处理组幼虫体重在基因沉默后的第1、3和7天显著高于对照组；化蛹过程中,处理组与对照组间的蛹重和化蛹率均无显著差异；羽化过程中,处理组比对照组推迟一天羽化,但两组间的羽化率和残翅率均无显著差异；在整个发育历期中,处理组与对照组试虫的死亡率均呈上升趋势,但无显著差异。研究结果表明HaCPR基因对棉铃虫生长发育有一定程度延缓发育的作用,但在整个发育过程中并不起到主要作用。