病毒载体介导家鸡多能细胞系的转基因技术研究

论文摘要

为建立家鸡的高效基因转移技术,本文从种蛋开窗技术的改进、用慢病毒表达载体将绿色荧光蛋白（GFP）基因转染种蛋内囊胚细胞和原生殖细胞、逆转录病毒载体转染睾丸细胞、人促红细胞生成素（hEPO）基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的构建等方面进行了研究,结果如下:1改进了种蛋开窗工具、开窗方法以及封口方法,使该方法更简单实用,制作效率提高了2倍以上,便于在实践中推广应用,并已申报国家发明专利（申请号CN200710034253.0,公开号CN101020898）。为解决目前因外源基因的随机整合,需要大量实验样本才能使转基因家鸡研究获得成功等问题奠定了基础。2家鸡种蛋自身含有禽胚胎干细胞（BCs）或原生殖细胞（PGCs）。采用Gateway技术构建了含绿色荧光蛋白（GFP）基因的pLenti6/v5-DEST-GFP慢病毒表达载体,转染体外培养的BCs,获得了约70%的表达效率。转染体内囊胚,孵化13d时,PCR检测阳性率为64.7%。转染血液循环中的PGCs:孵化率为35.0%,在出壳后死亡的3只小鸡肝脏中,GFP基因检出率为100%,其中一只小鸡的眼部能检测到绿色荧光;存活的4只鸡中有3只在12月龄的血液样品中,经PCR检测扩增出了GFP基因片段。3睾丸生精上皮内含有二倍体的精原干细胞,将这些细胞在体外转染,然后移植入经不育处理的受体公鸡睾丸,使其恢复生精能力并产生转基因精子,是家鸡基因转移的一种新方法。本文构建了含GFP基因的pLG逆转录病毒载体,滴度达到5×107 IU/mL,转染了体外培养的睾丸细胞,转染后培养到5 d时,流式细胞仪检测GFP基因的表达率为37.0%,碘化丙锭（PI）染色检测出的细胞活力达99.7%,而且整合的前病毒CpG甲基化程度相当低。转染后的睾丸细胞移植到7只经不育处理的公鸡睾丸,其中2只在2-3个月恢复了生精能力,经PCR扩增证实其产生的精子中含有转基因。4外源基因仅在输卵管组织中特异表达是家鸡转基因技术所追求的目标。从鸡输卵管基因组DNA中扩增出1.3kb的OV（卵清蛋白）基因5’端调控区,作为家鸡输卵管组织特异性表达启动子。从phEBS-HB质粒扩增出了2.1kb的hEPO（人促红细胞生成素）基因全长DNA片断,作为目的基因。为方便EPO的检测,构建了含hEPO和GFP的共表达载体pOV-GFP-hEPO。通过测序和转染体外培养的家鸡输卵管上皮细胞,证实载体构建正确并能表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 动物转基因技术研究现状
• 1.1 动物转基因技术的方法
• 1.2 动物转基因的表达与调控
• 1.3 家鸡转基因研究现状
• 1.3.1 家鸡转基因的表达载体
• 1.3.2 家鸡多能细胞
• 1.3.3 输卵管组织特异性表达的调控元件
• 1.3.4 激素和卵清蛋白基因的调控作用
• 1.3.5 家鸡转基因技术的应用前景
• 1.3.6 家鸡转基因技术存在的问题
• 2 研究目标与技术路线
• 第二章 改进种蛋开窗方法提高家鸡转基因技术
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 种蛋开窗后不注射胚的孵化率
• 2.2 种蛋开窗后注射胚的孵化率
• 3 讨论
• 3.1 开窗是导致种蛋孵化率下降的主要因素
• 3.2 种蛋开窗方法的改进
• 4 小结
• 第三章 以慢病毒为载体转染囊胚细胞和原生殖细胞的转基因家鸡
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 利用 Gateway技术构建绿色荧光蛋白基因慢病毒表达载体
• 1.2.2 慢病毒载体转染体外培养的囊胚细胞
• 1.2.3 慢病毒载体转染种蛋内囊胚细胞和原生殖细胞
• 1.2.4 转基因产物的PCR和荧光检测
• 2 结果与分析
• 2.1 慢病毒载体的PCR检测及载体滴度的测定
• 2.2 在体外培养囊胚细胞中表达的绿色荧光蛋白基因
• 2.3 慢病毒载体转染未孵化种蛋囊胚所产生的转基因鸡胚
• 2.4 慢病毒载体转染发育鸡胚中原生殖细胞产生的转基因家鸡
• 3 讨论
• 3.1 慢病毒载体及其 Gateway构建技术
• 3.2 囊胚细胞转染和原生殖细胞转染两种家鸡转基因方法的比较
• 4 小结
• 第四章 逆转录病毒载体转染睾丸细胞的转基因家鸡
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 通过射线辐照使公鸡的睾丸不育
• 1.2.2 逆转录病毒载体的构建
• 1.2.3 逆转录病毒对体外培养睾丸细胞的感染及检测
• 1.2.4 转染的睾丸细胞移植入不育公鸡的睾丸
• 2 结果
• 2.1 绿色荧光蛋白基因在体外培养睾丸细胞中的表达
• 2.2 转染睾丸细胞中逆转录病毒启动子区域的CpG甲基化分析
• 2.3 移植转染睾丸细胞后产生转基因精子的公鸡
• 3 讨论
• 4 小结
• 第五章 人促红细胞生成素基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 家鸡输卵管组织特异性启动子的克隆
• 1.2.2 人促红细胞生成素基因的克隆
• 1.2.3 人促红细胞生成素基因输卵管特异性表达载体的构建
• 1.2.4 构建的表达载体转染家鸡原代输卵管上皮细胞
• 2 结果
• 2.1 克隆基因的PCR扩增、酶切与测序鉴定
• 2.2 hEPO基因家鸡输卵管组织特异性表达载体的酶切鉴定
• 2.3 三种表达载体在鸡原代输卵管上皮细胞中的表达
• 3 讨论
• 3.1 OV基因5’端调控序列及hEPO基因的调控元件
• 3.2 GFP、hEPO基因的共表达及其检测方法
• 4 小结
• 第六章 结论
• 1 研究结果
• 2 创新点
• 3 展望
• 参考文献
• 符号表
• 致谢
• 作者简历