七氟烷后处理减轻兔脊髓缺血再灌注损伤及其机制的研究

论文摘要

主动脉瘤手术或脊髓手术等因术中阻断主动脉,均可能引起不同程度的脊髓缺血,导致神经功能障碍,严重者表现为急性或迟发性截瘫。虽然临床已采用脑脊液引流、低温、缺血和药物预处理等各种方法加以防治,但胸腹主动脉瘤手术患者的脊髓损伤发生率仍高达3%18%。因此,能否寻找有效措施减轻再灌注损伤已成为人们研究的热点。缺血后处理（ischemic postconditioning）概念的提出,为器官保护提供了新选择和新思路,因为后处理是在恢复全面血液灌注之前施予,方法简单、操作方便,无疑具有更直接的临床应用价值。本实验室以前的研究已经证明缺血后处理可以减轻兔脊髓再灌注损伤,其可能的机制与诱导热休克蛋白表达和抑制再灌注时氧自由基（OFR）的过量生成有关。麻醉药物如吸入麻醉药后处理可否模拟缺血后处理效应减轻脊髓再灌注损伤尚未见报道。七氟烷（Sevoflurane）是一种新型吸入麻醉药,因其麻醉诱导迅速、维持平稳、苏醒快速完全而广泛应用于临床麻醉,而且研究已证实七氟烷对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用。因此,本研究采用兔脊髓缺血再灌注模型,研究七氟烷后处理能否减轻兔脊髓再灌注损伤,并探讨测定七氟烷后处理与氧自由基、机体抗氧化酶活性以及线粒体ATP敏感性钾通道(KATP)的关系,明确七氟烷后处理保护脊髓损伤的部分机制。实验一七氟烷后处理减轻兔脊髓缺血再灌注损伤目的探讨七氟烷后处理是否能减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。方法清洁级雄性新西兰大白兔48只,随机分为6组（n=8）:假手术组（Sham组）,仅行单纯手术操作但不阻闭腹主动脉;对照组（Control组）,行单纯缺血再灌注,即阻闭腹主动脉20 min后进行再灌注;纯氧后处理组（O2组）,在再灌注前5 min给予100% O2,持续13 min。七氟烷后处理组（Sevo 0.5组/Sevo 1.0组/Sevo 1.5组）,分别在再灌注前5 min给予0.5、1.0及1.5MAC七氟烷处理,持续10 min,然后100% O2洗脱3 min。再灌注48 h对所有动物的后肢运动功能进行评分并取脊髓(L5～7)行HE染色对脊髓前角正常神经元进行计数。结果再灌注48 h,七氟烷后处理组动物后肢运动功能评分显著于高于对照组（P<0.05）而Sevo 0.5、Sevo 1.0和Sevo 1.5组间无显著差异。七氟烷后处理组脊髓前角正常神经元数量明显多于对照组（P<0.05）,而且Sevo 1.0组脊髓前角正常神经元数量明显多于Sevo 0.5及Sevo 1.5组（P<0.05）。结论七氟烷后处理可减轻兔脊髓缺血再灌注损伤,1.0MAC七氟烷后处理的保护效应较强。实验二氧自由基清除剂MPG对七氟烷后处理脊髓保护作用的影响目的探讨氧自由基在七氟烷后处理减轻兔脊髓缺血再灌注损伤中的作用。方法雄性新西兰大白兔36只,随机分为6组（n=6）。纯氧组（O2）及七氟烷（Sevo）组,分别接受纯氧和1.0MAC七氟烷后处理并于再灌注前15 min开始静脉泵注20 min去离子水0.5 ml·kg-1·min-1;MPG+七氟烷（MPG+Sevo）及MPG+纯氧组（MPG+O2）,分别接受1.0MAC七氟烷和纯氧后处理并于再灌注前15 min开始静脉泵注20 min 2%氧自由基清除剂2-巯基丙酰甘氨酸（MPG）0.5 ml·kg-1·min-1;七氟烷+MPG（Sevo+MPG）及纯氧+MPG组（O2+MPG）,分别接受1.0MAC七氟烷和纯氧后处理并于再灌注后15 min静脉泵注20 min 2% MPG 0.5 ml·kg-1·min-1。各后处理组后处理方法同第一部分实验后处理条件。再灌注48 h对所有动物的后肢运动功能进行评分并取脊髓（L5～7）行HE染色观察对脊髓前角正常神经元进行计数。结果再灌注48 h,Sevo及Sevo+MPG组后肢运动功能评分显著高于O2组及MPG+Sevo组（P<0.05）,并且脊髓前角正常神经元数量显著多于O2组及MPG+Sevo组（P<0.05）,而Sevo和Sevo+MPG组后肢运动功能评分和脊髓前角正常神经元计数差异无显著意义。结论氧自由基清除剂MPG可消除七氟烷后处理的脊髓保护作用,表明氧自由基参与七氟烷后处理减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。实验三七氟烷后处理对兔脊髓再灌注后抗氧化酶活性及MDA含量的影响目的探讨七氟烷后处理是否通过增加再灌注期间内源性抗氧化物酶的活性减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。方法雄性新西兰大白兔80只,随机分为4组（n=20）:假手术组（Sham组）:操作同对照组,但不阻闭腹主动脉;对照组（Control组）:阻闭腹主动脉20 min后再灌注;纯氧（O2组）及七氟烷后处理组（Sevo组）:阻闭腹主动脉20 min,采用纯氧以及1.0MAC七氟烷后处理,后处理方法同第一部分实验后处理条件。在再灌注的1 h、6 h、24 h和48 h分别取脊髓（L57）,采用分光光度法测定脊髓超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）活性及丙二醛（MDA）含量测定（各时间点n=5）。再灌注6 h、24 h和48 h在取材前分别行后肢运动功能评分。结果（1）再灌注6 h、24 h和48 h时Sevo组后肢运动功能评分显著高于Control组（P<0.05）。（2）Sevo组脊髓组织中SOD活性在再灌注早期1 h、6 h及24 h显著高于Control组（P<0.05）; CAT活性在再灌注1 h、6 h显著高于Control组（P<0.05）。Sevo组各时间点脊髓组织GSH-px活性与Control组相比差异无显著意义。（3）Sevo组脊髓组织MDA含量在再灌注6 h、24 h和48 h明显低于Control组（P<0.05）。结论七氟烷后处理可通过上调再灌注后脊髓SOD及CAT活性,减少脊髓脂质过氧化,从而减轻脊髓缺血再灌注损伤。实验四氧自由基清除剂MPG对七氟烷后处理后脊髓抗氧化酶活性及MDA含量的影响目的探讨氧自由基清除剂MPG对七氟烷后处理后脊髓抗氧化酶活性及MDA的影响。方法雄性新西兰大白兔24只,随机分为4组（n=6）:对照组（Control组）:阻闭腹主动脉20 min后再灌注并于再灌注前15 min开始静脉泵注去离子水0.5 ml·kg-1·min-1持续20 min;七氟烷后处理组（Sevo组）:阻闭腹主动脉20 min,采用1.0MAC七氟烷后处理,并于再灌注前15 min开始静脉泵注去离子水0.5 ml·kg-1·min-1持续20 min;MPG+七氟烷组（MPG+Sevo组）:阻闭腹主动脉20 min,采用1.0MAC七氟烷后处理,并于再灌注前15 min开始静脉泵注2% MPG 0.5 ml·kg-1·min-1持续20 min;MPG组（MPG组）:阻闭腹主动脉20 min,再灌注前15 min开始静脉泵注20 min 2% MPG 0.5 ml·kg-1·min-1持续20 min。各后处理组方法同第一部分实验后处理条件。再灌注6 h行后肢运动功能评分,并取脊髓（L5～7）用分光光度法测定超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量测定,并在取材前分别行后肢运动功能评分。结果再灌注6 h时Sevo组后肢运动功能评分和脊髓SOD、CAT活性均显著高于Control组、MPG组以及MPG+Sevo组（P<0.05）;脊髓MDA含量低于Control组、MPG组以及MPG+Sevo组（P<0.05）;而Control组、MPG组以及MPG+Sevo组之间无显著差异。结论氧自由基清除剂MPG通过抑制七氟烷后处理引起的抗氧化酶活性增高而取消了七氟烷后处理的脊髓保护作用。实验五线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-HD对七氟烷后处理脊髓保护作用的影响目的探讨线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-HD对七氟烷后处理保护兔脊髓缺血再灌注损伤的影响。方法雄性新西兰大白兔32只,随机分为4组（n=8）:纯氧（O2）组及七氟烷（Sevo）组:阻闭腹主动脉20 min后再灌注,分别接受纯氧和1.0 MAC七氟烷后处理并于再灌注前10 min静脉注射生理盐水2 ml/kg;5-HD+七氟烷（5-HD+Sevo）组及5-HD+纯氧（5-HD+O2）组:分别接受1.0MAC七氟烷和纯氧后处理并于再灌注前10min静脉注射10%选择性线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-羟基癸酸甘油酯（5-HD）2 ml/kg。再灌注48 h对所有动物的后肢运动功能进行评分,并取脊髓（L5～7）行HE染色观察脊髓前角正常神经元计数。结果再灌注48 h,Sevo组后肢运动功能评分显著高于O2组、5-HD+Sevo组和5-HD+O2组（P<0.05）,并且脊髓前角正常神经元数量显著多于O2组、5-HD+Sevo组和5-HD+O2组（P<0.05）,而O2组、5-HD+Sevo组和5-HD+O2组后肢运动功能评分和脊髓前角正常神经元计数差异无显著意义。结论线粒体ATP敏感性钾通道抑制剂5-HD可消除七氟烷后处理的脊髓保护作用,表明七氟烷后处理通过激活线粒体ATP敏感性钾通道的开放从而减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。小结1. 0.5、1.0、1.5MAC七氟烷后处理均可减轻兔脊髓缺血再灌注损伤,其中1.0MAC七氟烷后处理的保护效应较强。2.七氟烷后处理可以诱导氧自由基的适度产生从而上调内源性抗氧化酶的活性,抑制再灌注期间脂质过氧化,产生脊髓保护效应。3.七氟烷后处理通过激活线粒体ATP敏感性钾通道开放从而减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 1. 脊髓缺血-再灌注损伤机制及保护措施
• 2. 后处理与脊髓缺血再灌注损伤
• 正文
• 实验一 七氟烷后处理减轻兔脊髓缺血再灌注损伤
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 氧自由基清除剂MPG 对七氟烷后处理脊髓保护作用的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 七氟烷后处理对兔脊髓再灌注后抗氧化酶活性及MDA 含量的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 氧自由基清除剂MPG 对七氟烷后处理后脊髓抗氧化酶活性及MDA 的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验五 线粒体ATP 敏感性钾通道抑制剂5-HD 对七氟烷后处理神经保护作用的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢