冬凌草甲素诱导MDA-MB-231细胞凋亡机制及抑制肿瘤转移相关酶的实验研究

论文摘要

目的冬凌草甲素（oridonin）是从唇形科（Labtea）香茶菜属（Rabdosia）植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类（ent—kaurene diterpenoid）天然有机化合物,主要植物来源有:香茶菜（Rabdosia amethystoides）,显脉叶香茶菜（Rabdosia nervosa）,毛叶香茶菜（Rabdosia jabdsia）,道孚香茶菜（Rabdosia downsis）和冬凌草或碎米亚（Rabdosia rubescens）,延命草（Isodon japonicus）。分子式为C20H28O6,相对分子量364.4。研究证明其具有抗肿瘤细胞增殖及促肿瘤细胞凋亡的生物学作用,有“紫杉醇第二”的美称。实验研究表明,冬凌草甲素对多种肿瘤细胞,尤其对肝癌、白血病、淋巴瘤细胞,有明显抑制作用。而冬凌草甲素诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的研究,目前尚未见文献报道。本实验主要研究冬凌草甲素对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制效应和诱导该细胞凋亡作用及其分子机制,并从抗肿瘤转移的角度,研究冬凌草甲素对乙酰肝素酶和金属基质蛋白酶的影响,从而为冬凌草甲素应用于临床治疗乳腺癌提供实验依据。方法1.体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,实验随机分为正常对照组、冬凌草甲素处理组（浓度分别为5、10、20、40μmol/L ）。2.冬凌草甲素分别处理24h、48h、72h后,采用细胞毒（MTT法）实验检测乳腺癌细胞抑制率并计算IC50值。3.药物处理72h后,用倒置显微镜观察细胞形态变化。4.药物处理48h后,DNA琼脂糖凝胶电泳观察药物作用后的DNA条带（DNA Ladder）。5.药物处理48h后,半定量RT-PCR测定基因bcl-xl、bid、caspase-3和heparanase（乙酰肝素酶,Hpa）的表达变化。6.药物处理48h后,流式法检测细胞凋亡。7.药物处理48h后,明胶酶谱法测金属基质蛋白酶MMP-2和MMP-9活性。结果1.冬凌草甲素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖有较强的抑制作用,且这种作用呈一定的剂量和时间依赖性。5、10、20、40μmol/L冬凌草甲素处理MDA-MB-231细胞24h,细胞抑制率分别为（10.223±3.176）%、（12.799±2.335）%、,（44.924±5.58）和（ 56.654±2.315 ） % ;处理48h,细胞抑制率分别为（11.662±4.253）%、（16.367±1.032）%、（52.762±3.390）%和（60.908±3.211）%;处理72h,细胞抑制率分别为（22.092±5.960）%（77.992±1.524）%、（91.716±0.458）%和（95.176±0.780）%。冬凌草甲素处理24h、48h和72h的IC50分别为30.62 , 25.45和7.210μmol/L。2.观察到细胞形态和特有的生化特征。形态学观察可见部分细胞自瓶壁脱离、崩解死亡,悬浮与培养液中,部分胞体变细变小,部分细胞边界不清,胞浆内颗粒粗大,少数的细胞仍贴壁生长,残存细胞形态不规则,状态差,反光差;空白对照组细胞贴壁紧,形态规则状态良好,反光强。生化方面,DNA琼脂糖凝胶电泳可见DNA梯状条带,而正常对照组没有出现上述特征。3.半定量RT-PCR检测结果显示,bcl-xl mRNA表达下调,而bid和caspase-3 mRNA表达上调。5, 10, 20和40μmol/L冬凌草甲素处理组bcl-xl/GAPDH光密度积分值之比分别为0.347±0.016,0.267±0.019,0.137±0.045和0.073±0.020,与正常对照组0.370±0.026相比有显著差异;bid/GAPDH光密度积分值之比分别为0.237±0.044, 0.397±0.025, 0.650±0.050和0.870±0.030与正常对照组0.183±0.021相比有显著差异;caspase-3/GAPDH光密度积分值之比分别为0.123±0.059, 0.223±0.015, 0.283±0.021和0.357±0.025与正常对照组0.073±0.015相比有显著差异。4.流式细胞仪检测,48h凋亡率为75%。5.半定量RT-PCR检测结果显示,Hpa mRNA表达下调,Hpa/GAPDH光密度积分值之比分别为0.616±0.032, 0.565±0.019, 0.434±0.021和0.348±0.028与正常对照组0.654±0.033相比有差异。6.明胶酶谱法检测结果显示,MMP-2,MMP-9的活性降低。5, 10, 20和40μmol/L冬凌草甲素处理组与对照组MMP-2光密度积分值之比分别为0.920±0.020, 0.790±0.026, 0.610±0.035和0.277±0.025;MMP-9光密度积分值之比分别为0.917±0.065, 0.797±0.015, 0.483±0.032和0.210±0.026。结论1.一定浓度的冬凌草甲素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞具有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用,冬凌草甲素具有较好的抗乳腺癌作用。2.冬凌草甲素能下调bcl-xl基因表达,上调bid和caspase-3基因表达,说明冬凌草甲素诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡可能与线粒体通路有关,而bid和bcl-xl可能是冬凌草甲素的调控靶点。3.冬凌草甲素可下调乙酰肝素酶的基因表达,并抑制MMP-2,MMP-9（金属基质蛋白酶2,9）的活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养和实验分组
• 2.2.2 细胞毒实验（MTT 法）
• 2.2.3 细胞形态学观察
• 2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 梯形条带
• 2.2.5 半定量 RT-PCR 检测相关基因的表达变化
• 2.2.6 流式细胞仪测凋亡
• 2.2.7 明胶酶谱法检测 MMP-2，MMP-9
• 2.2.8 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 冬凌草甲素对人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的生长抑制作用
• 3.2 显微镜观察细胞形态变化
• 3.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测MDA-MB-231 细胞凋亡
• 3.4 半定量 RT-PCR 检测乳腺癌 MDA-MB-231 细胞凋亡相关基因的表达结果
• 3.5 流式法检测细胞凋亡
• 3.6 半定量 RT-PCR 检测乳腺癌 MDA-MB-231 细胞乙酰肝素酶基因的表达结果
• 3.7 酶谱法检测 MMP2 和 MMP9 活性
• 第4章 讨论
• 4.1 冬凌草甲素对肿瘤细胞的生长抑制作用
• 4.2 冬凌草甲素对细胞凋亡相关基因 Bid,Bcl-xl,caspase 3 表达的影响
• 4.3 冬凌草甲素对细胞形态及 DNA 的影响
• 4.4 冬凌草甲素对细胞凋亡的影响
• 4.5 冬凌草甲素对肿瘤转移相关因素的影响
• 4.5.1 冬凌草甲素对乙酰肝素酶的影响
• 4.5.2 冬凌草甲素对基质金属蛋白酶的影响
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果