视黄醇结合蛋白的表达及其单抗在临床检测中的应用

论文摘要

近年来,肾小管疾病在泌尿系统疾病中的发病率逐年升高,越来越受到人们的关注。据统计,20%-40%慢性肾功能衰竭患者是由肾小管疾病所致。肾小管损伤时,一些特异性标志蛋白会在尿液中排出。尿液中这些标志物的检测有助于肾小管疾病的早期诊断和治疗。视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein, RBP）是一类在人体内负责从肝脏转运视黄醇至各组织细胞的运载蛋白,对视黄醇生理功能的发挥起着重要作用。RBP主要在肝脏中合成。肝脏中分泌的RBP-视黄醇聚合物与转铁蛋白（Transthyretin,TTR）形成稳定的蛋白复合物在血液系统中循环。RBP-视黄醇-TTR复合体在视黄醇释放后解体,RBP以游离形式存在于血液系统中,游离的RBP在肾近曲小管被重新吸收和分解。当肾小管损伤时,尿液中RBP含量会有不同程度的上调。因此尿液中RBP的含量可作为诊断肾小管损伤的指标。目前RBP抗体均由天然蛋白免疫动物获得。人体中RBP含量甚微,此外RBP纯化繁琐、得率较低、成本较高。因此获得天然纯化的RBP非常困难。本研究采用原核表达的方法,在E.coli中表达并纯化RBP,制备了识别天然RBP的单抗S-59-1和S-59-2。经鉴定,两株单抗均识别170-201氨基酸范围的表位。通过尿RBP商业化试剂盒替换实验表明,这两株单抗均可用于包被或检测,为下一阶段自主试剂盒的研发创造了有利条件。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一篇 实验部分
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 动物
• 1.1.2 溶液
• 1.1.3 培养液
• 1.1.4 其他
• 1.2 方法
• 1.2.1 mRNA 抽提
• 1.2.2 反转录
• 1.2.3 转化
• 1.2.4 RBP 表达载体构建
• 1.2.5 RBP 蛋白的表达和纯化
• 1.2.6 RBP 单克隆抗体的制备
• 1.2.6.1 动物免疫
• 1.2.6.2 单克隆抗体制备
• 1.2.6.3 单抗的鉴定
• 1.2.6.4 Protein G 纯化抗体
• 1.2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.2.7.1 RBP 单克隆抗体工作浓度确定
• 1.2.7.2 试剂盒检测尿液 RBP
• 1.2.7.3 间接 ELISA
• 1.2.7.4 夹心ELISA
• 1.2.8 抗体亚型检测
• 1.2.9 Western-Blot
• 2. 结果
• 2.1 RBP 基因的克隆和蛋白表达
• 2.1.1 RBP 基因的克隆
• 2.1.2 RBP 基因及其片段的表达纯化
• 2.1.2.1 RBP 全长基因表达纯化
• 2.1.2.2 RBP 基因片段表达
• 2.2 RBP 单克隆抗体的制备
• 2.3 RBP 单克隆抗体的特异性
• 2.4 Protein G 纯化和 HRP 标记
• 2.5 单克隆抗体性质的研究
• 2.6 尿液样本 RBP 检测
• 2.7 夹心 ELISA
• 3. 讨论
• 4. 小结
• 参考文献
• 第二篇 文献综述大肠杆菌表达系统研究进展
• 1. 表达载体
• 1.1 表达调控元件
• 1.2 融合标签
• 1.3 共表达载体
• 2. 宿主细胞
• 2.1 蛋白酶缺陷株
• 2.2 糖基化
• 2.3 稀有密码子
• 2.4 二硫键
• 参考文献
• 附录
• 致谢