荔枝果肉多糖超声微波酶解协同提取及其生物活性初析

论文摘要

荔枝是华南地区特色水果,其果香独特、营养丰富,具有显著的滋补功效。现代研究表明,荔枝果肉具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫等活性作用,而荔枝果肉活性多糖被证实是其具有保健作用的重要物质基础之一。本文通过优化荔枝果肉多糖的超声微波酶解协同提取工艺,比较了此方法与传统热水法提取的荔枝多糖的体外抗氧化活性、免疫调节活性及其结构特征差异；确定荔枝多糖离子层析分级条件,比较其组分体外抗氧化活性、免疫调节活性,并初步解析其基本结构,为荔枝制品尤其为功能食品的开发及应用奠定基础。论文的主要研究结果如下：1.超声微波酶解协同提取荔枝多糖：采用响应面法分析设计五因素三水平试验,优化荔枝果肉多糖的超声微波酶解协同提取工艺。经分析并结合验证试验,确定荔枝多糖的最佳提取工艺条件为：纤维素酶（酶活为30U/mg）添加量14mg/g（与底物之比1,料液比1：10,温度49℃,pH值4.8,提取时间12min。在该条件下,荔枝多糖得率可达23.31%,比传统热水法、超声法、微波法分别提高18.95%、4.37%和17.10%（P<0.05）。2.超声微波酶解协同法与热水法提取荔枝多糖的活性比较及结构初析：比较两种方法提取荔枝多糖（LCP）体外还原Fe3+能力、清除DPPH自由基、ABTS自由基的结果显示,超声微波酶解法提取的LCP清除DPPH·和ABTS·+的IC50分别为427μg/mL、203μg/mL,显著低于同浓度下热水法提取的LCP清除DPPH·（?）和ABTS·+的IC50（2734μg/mL、1590μg/mL, P<0.05）; FRAP抗氧化值为0.32μmol/mg,显著高于热水法提取LCP的FRAP值（0.16μmol/mg, P<0.01）,表明超声微波酶解法提取LCP的抗氧化能力显著高于热水法提取的LCP。同时,细胞活性实验的结果表明,超声微波酶解法提取的LCP促进脾淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤能力的活性显著（P<0.05）高于热水法提取的LCP。对两种方法提取的LCP特性分析的结果表明,超声微波酶法提取的LCP水溶性多糖含量为57.26%,糖醛酸含量为12.39%；热水法提取的LCP水溶性多糖的含量47.62%,糖醛酸的含量23.69%；红外光谱、气相色谱—质谱（GC-MS）、凝胶色谱的分析结果显示,超声微波酶法提取的LCP为具卤素取代的α-吡喃型多糖,由木糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等单糖组成（摩尔比为1：4.39：6.05：16.07：65.20：23.62：15.25）,分子量为7.92x104和9.09×10。；热水法提取的LCP为具O-糖苷键结合的有蛋白的多糖,由木糖、鼠李糖、核糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等单糖组成（摩尔比为1：2.59：5.77：8.13：22.49：22.50：26.02）,分子量为6.01×104。两种方法提取LCP的水溶性多糖含量、单糖组成和分子量的差异可能是造成其活性差异的基础。3.层析条件优化及级分分离：优化荔枝多糖DEAE-52离子层析的分级条件,确定其最适分级条件为：上样浓度为4.2mg/ml,上样体积为8ml,柱流速为1ml/min）径长比为1：30,上样重复利用两次,梯度洗脱液为0.1mol/LNaCl,0.2mol/LNaCl,0.3 mol/LNaCl和0.3mol/LNaOH。采用该方法对提取的荔枝粗多糖进行分级纯化,得到LCP1-5五个组分,洗脱率为91.10%：0.78%：0.42%：0.11%：1.09%。4.荔枝多糖主级分的生物活性及其结构特征比较：选取DEAE-52层析分离纯化得到的主组分LCP1和LCP5,比较其FRAP抗氧化活性及促进脾淋巴细胞增殖、NK细胞杀伤的能力。结果显示,LCP5的FRAP抗氧化活性（1.28μmol/mg）显著高于LCP1（0.136μmol/mg, P<0.05）。同时,LCP5促进脾淋巴细胞增殖活性显著强于LCP1（P<0.01）；在浓度为300μg/mL和400μg/mL（?）时,其促进NK细胞杀伤能力的活性显著高于LCP1（P<0.05）。对其理化特性分析的结果显示,LCP1的水溶性多糖含量为63.16%,糖醛酸含量为32.36%,紫外光谱分析显示其含有少量核酸和蛋白质；LCP5的水溶性多糖含量为42.84%,糖醛酸含量为10.82%。红外光谱、GC-MS和高效凝胶渗透色谱的分析结果显示,LCP1为具端炔基酸性多糖,由核糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖按1：1.58：2.66：4.97：9.15：11.14构成,其数均分子量为5.45×104；LCP5为具卤素取代的α-吡喃型酸性多糖,由核糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖按1：0.75：1.49：3.20：4.82：2.09构成,其数均分子量为1.41×104。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 绪论
• 1 多糖的研究概况
• 1.1 多糖的提取
• 1.2 多糖的分离
• 1.3 多糖的纯化
• 1.4 多糖的组成与结构
• 1.5 多糖的生物活性
• 2 荔枝多糖的研究进展
• 2.1 荔枝多糖的提取
• 2.2 荔枝多糖的纯化
• 2.3 荔枝多糖的结构分析
• 2.4 荔枝多糖的生物活性
• 2.4.1 抗氧化活性
• 2.4.2 免疫调节活性
• 3 本研究的目的意义和主要内容
• 3.1 本研究的目的和意义
• 3.2 本课题研究的主要内容
• 3.3 技术路线
• 第二章 荔枝多糖超声微波酶解协同提取工艺优化
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.1.1 原料
• 1.1.2 试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 荔枝干制备
• 2.2 荔枝果肉粉制备
• 2.3 荔枝多糖的提取
• 2.4 工艺酶种的筛选
• 2.5 单因素试验
• 2.6 多因素试验
• 2.7 不同提取方法对荔枝多糖提取得率的影响
• 2.8 多糖含量的测定与计算
• 2.9 数据处理
• 3 结果与讨论
• 3.1 不同酶种对荔枝多糖得率的影响
• 3.2 单因素试验结果
• 3.2.1 纤维素酶的添加量
• 3.2.2 料液比
• 3.2.3 酶解温度
• 3.2.4 酶解pH
• 3.2.5 酶解时间
• 3.3 多因素条件优化
• 3.3.1 回归模型的检验
• 3.3.2 双因素交互作用分析
• 3.3.3 最佳优化条件
• 3.4 不同提取方法对荔枝多糖提取得率的影响
• 4 讨论与结论
• 第三章 超声微波酶解协同法和热水法提取的荔枝多糖的活性比较及结构初析
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 样品制备
• 2.2 体外抗氧化活性的评价试验
• 2.2.1 样品溶液的配制
• 2.2.2 铁离子还原测定法（FRAP）
• 2.2.3 DPPH自由基清除能力的测定
• 2.2.4 ABTS自由基清除能力的测定
• 2.3 体外免疫活性的评价试验
• 2.3.1 样品溶液的配制
• 2.3.2 脾淋巴细胞悬液的制备
• 2.3.3 脾淋巴细胞的增殖试验
• 2.3.4 NK细胞活性的测定
• 2.4 理化性质
• 2.4.1 多糖含量的测定
• 2.4.2 糖醛酸含量的测定
• 2.4.3 蛋白质含量的测定
• 2.5 结构分析
• 2.5.1 紫外光谱检测
• 2.5.2 红外光谱鉴定
• 2.5.3 分子量测定
• 2.5.4 GC-MS分析
• 2.6 统计学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 LCP体外抗氧化活性的比较
• 3+还原能力的比较'>3.1.1 对Fe³⁺还原能力的比较
• 3.1.2 对DPPH自由基清除能力的比较
• 3.1.3 对ABTS自由基清除能力的比较
• 3.2 体外免疫活性的比较
• 3.2.1 直接促进脾淋巴细胞增殖的比较
• 3.2.2 协同刀豆蛋白ConA促进脾淋巴细胞增殖的比较
• 3.2.3 协同脂多糖LPS促进脾淋巴细胞增殖的比较
• 3.2.4 提高NK细胞活性的比较
• 3.3 理化性质
• 3.4 结构分析
• 3.4.1 紫外分析
• 3.4.2 红外可见光谱分析
• 3.4.3 分子量测定
• 3.4.4 GC-MS分析
• 4 讨论与结论
• 第四章 荔枝多糖的分级条件优化
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 样品溶液的配制
• 2.2 纯化工艺
• 2.3 DEAE-52纤维柱层析纯化
• 2.3.1 DEAE-52的预处理
• 2.3.2 纤维素层析柱的制备
• 2.3.3 上样
• 2.3.4 洗脱及收集
• 2.3.5 离子交换纤维素的再生与保存
• 2.4 洗脱条件的筛选
• 2.4.1 洗脱溶剂的确定
• 2.4.2 不同浓度多糖的最大上样体积
• 2.4.3 最佳上样浓度的确定
• 2.4.4 最佳上样体积的确定
• 2.4.5 最佳洗脱流速的确定
• 2.4.6 径长比的确定
• 2.4.7 使用次数的确定
• 2.5 纯化结果
• 2.6 多糖含量测定
• 2.7 洗脱率的计算
• 2.8 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 洗脱溶剂的确定
• 3.2 不同浓度多糖的最大上样体积
• 3.3 上样浓度
• 3.4 上样体积
• 3.5 洗脱流速
• 3.6 径长比
• 3.7 重复利用性
• 3.8 DEAE-52纤维素柱纯化结果
• 3.8.1 0.1mol/L NaCl洗脱曲线
• 3.8.2 0.2mol/L NaCl洗脱曲线
• 3.8.3 0.3mol/L NaCl洗脱曲线
• 3.8.4 0.3mol/L NaOH洗脱曲线
• 4 讨论与结论
• 第五章 荔枝多糖的活性成分分析
• 1 材料与仪器
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 2 方法
• 3+还原测定法（FRAP）'>2.1 LCP1和LCP5 Fe³⁺还原测定法（FRAP）
• 2.2 LCP1和LCP5体外免疫活性评价实验
• 2.3 理化性质
• 2.3.1 多糖含量的测定
• 2.3.2 糖醛酸的测定
• 2.3.3 蛋白质的测定
• 2.4 结构分析
• 2.4.1 紫外光谱分析
• 2.4.2 红外光谱鉴定
• 2.4.3 分子量测定
• 2.4.4 GC-MS分析
• 2.4 数据统计
• 3 结果与分析
• 3+还原能力的比较'>3.1 LCP1和LLCP5对Fe³⁺还原能力的比较
• 3.2 LCP1和LCP5组分体外免疫活性的比较
• 3.2.1 促脾淋巴细胞增殖的比较
• 3.2.2 NK细胞活性的比较
• 3.3 理化性质
• 3.4 结构分析
• 3.4.1 紫外分析
• 3.4.2 红外可见光谱分析
• 3.4.3 分子量测定
• 3.4.4 GC-MS分析
• 4 讨论与结论
• 结论与展望
• 结论
• 创新点
• 前景与展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录