番茄中miR397靶基因LeLACmiR397的克隆与表达分析

论文摘要

LAC（EC 1.10.3.2）/漆酶是一类含铜的糖蛋白（多酚氧化酶）,存在于植物、真菌、昆虫和细菌等多种有机体中,在木质素合成、离子吸收和逆境响应等方面具有重要功能,并在转录后水平受多种microRNA的调控。本研究在GenBank进行BLAST分析,获得了15个番茄LAC基因相关的EST片段,并对这些EST进行了同源比较和序列拼接,得到一个含有小分子RNA miR397识别位点的LAC基因片段。然后,根据该片段的核苷酸序列信息进行5’-和3’-RACE扩增,得到了番茄LAC基因的全长cDNA（LeLACmiR397,登录号EU503151）。氨基酸序列分析表明,LeLACmiR397蛋白与南芥AtLAC7和豌豆PsLAC同源性最高。蛋白质结构域推测表明,LeLACmiR397蛋白存在一个Cu-氧化酶结构域。LeLACmiR397基因的时空表达分析表明,该基因在根、花、成熟果实和愈伤组织中特异性表达,而在叶和茎中不表达。鉴于小分子RNA miR397在不同植物中是高度保守的,为了检测miR397对LeLACmiR397基因的转录后调控,以拟南芥基因组DNA为模板,克隆了miR397a基因的前体序列,并构建了miR397a的表达载体,用农杆菌侵染法转化番茄子叶,获得了转基因番茄植株。表达分析表明,LeLACmiR397基因在非转基因番茄的成熟果实和根中表达,但在转基因番茄的果实和根中检测不到LeLACmiR397基因表达,所以,LeLACmiR397基因可能受miR397a的转录后调控,发生基因沉默。LeLACmiR397基因编码多酚氧化酶,转基因番茄中多酚氧化酶活性分析表明,转基因植株的多酚氧化酶活性低于非转基因植株。盐胁迫下转基因番茄酶活性分析表明,转基因植株中三种抗性相关酶（超氧化物歧化酶SOD、多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD）的活性均低于非转基因植株,表明miR397对LeLACmiR397基因的转录后调控是植物抗逆性形成的负调控因素。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 LAC 基因的研究进展
• 1.1.1 LAC 基因在植物中具有多种生理功能
• 1.1.2 LAC 基因表达受microRNA 介导的转录后调控
• 1.2 植物miRNA 的研究进展
• 1.2.1 植物miRNA 与其它生物miRNA 的异同点
• 1.2.2 植物miRNA 的形成
• 1.2.3 植物miRNA 的作用机制
• 1.2.4 植物miRNA 的功能
• 1.3 发现miRNA 及其靶基因的研究方法
• 1.3.1 发现miRNA 的研究方法
• 1.3.2 发现miRNA 靶基因的方法
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.1.1 供试材料
• 2.2.1.2 植物材料的盐处理
• 2.1.2 菌株及质粒
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 主要化学试剂和试剂盒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CTAB 法提取RNA
• 2.2.2 RNA 含量和纯度检测
• 2.2.3 第一链含有锚定引物的cDNA 的合成
• miR397 基因全长cDNA 克隆'>2.2.4 LeLAC^miR397 基因全长cDNA 克隆
• miR397 基因中间片断的扩增'>2.2.4.1 LeLAC^miR397基因中间片断的扩增
• miR397 基因5′端cDNA 序列的扩增'>2.2.4.2 LeLAC^miR397 基因5′端cDNA 序列的扩增
• miR397 基因3′端cDNA 序列的扩增'>2.2.4.3 LeLAC^miR397 基因3′端cDNA 序列的扩增
• miR397 基因cDNA 全长序列的获得'>2.2.4.4 LeLAC^miR397 基因cDNA 全长序列的获得
• 2.2.5 PCR 扩增产物的回收
• 2.2.6 PCR 回收产物的克隆
• 2.2.7 模板DNA 的制备
• 2.2.8 克隆载体的酶切鉴定
• 2.2.9 序列测定及分析
• 2.2.10 表达载体构建
• 2.2.11 根癌农杆菌LBA4404 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.11.1 感受态细胞的制备
• 2.2.11.2 冻融法农杆菌转化
• 2.2.12 农杆菌介导的番茄转化
• 2.2.13 逆境胁迫下转基因植株的生理生化测定
• 2.2.13.1 SOD 活性的测定方法
• 2.2.13.2 PPO 活性的测定方法
• 2.2.13.3 POD 活性的测定方法
• 3 结果与分析
• miR397 片段的分子克隆'>3.1 番茄中miR397 靶基因LeLAC^miR397片段的分子克隆
• miR397 的全长cDNA'>3.2 RT-PCR 和RACE 扩增获得LeLAC^miR397的全长cDNA
• miR397 基因的序列分析'>3.3 LeLAC^miR397基因的序列分析
• miR397 基因的氨基酸同源性分析'>3.3.1 LeLAC^miR397基因的氨基酸同源性分析
• miR397 基因蛋白质结构域预测'>3.3.2 LeLAC^miR397基因蛋白质结构域预测
• miR397 基因的表达分析'>3.4 LeLAC^miR397基因的表达分析
• miR397 基因受转录后水平调控'>3.5 LeLAC^miR397基因受转录后水平调控
• 3.5.1 拟南芥miR397a 基因的克隆
• 3.5.2 番茄植物表达载体的构建
• 3.5.3 p81121-miR397a 转基因番茄的获得
• miR397 基因的转录后调控'>3.5.4 转基因番茄中LeLAC^miR397基因的转录后调控
• miR397 基因沉默对逆境抗性的影响'>3.6 LeLAC^miR397基因沉默对逆境抗性的影响
• 3.6.1 转基因植株酶活性的变化
• miR397 基因与抗盐性分析'>3.6.2 番茄LeLAC^miR397基因与抗盐性分析
• miR397 基因沉默引起的酶活性变化'>3.6.2.1 盐胁迫下番茄LeLAC^miR397基因沉默引起的酶活性变化
• miR397 基因沉默引起的表型变化'>3.6.2.2 盐胁迫下番茄LeLAC^miR397基因沉默引起的表型变化
• 4 讨论
• miR397 的基因特征'>4.1 番茄LeLAC^miR397的基因特征
• miR397 基因转录后调控分析'>4.2 miR397a 对番茄LeLAC^miR397基因转录后调控分析
• miR397 基因的功能分析'>4.3 番茄LeLAC^miR397基因的功能分析
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢