RACE法克隆紫花苜蓿光敏色素A基因

论文摘要

许多国家栽培苜蓿时,多把秋眠性作为品种选择的首要指标,因此对秋眠性的研究引起了苜蓿栽培国家科学家们的广泛关注。已经证明短日照是引起苜蓿秋眠性的主要环境因子,说明苜蓿的秋眠存在着光周期效应,而与光周期密切相关的是光受体,光敏色素A、B又是植物中最重要的光受体,因此我们推测光敏色素与苜蓿的秋眠存在着一定的关系。这对于解决国际上秋眠机理不清的问题有极为重要的意义。实验提取紫花苜蓿总RNA,通过RT-PCR获得phyA基因片段,送测序公司进行产物PCR测序,测序结果经BLAST比较,与其他豆科植物phyA基因同源性达90%以上,证明该cDNA序列为紫花苜蓿的phyA基因片段。然后再选取效果比较好的WL-525样本RNA进行后续3′RACE和5′RACE实验。实验通过改进和优化PCR条件,很有效地扩增出目的片段,并将目的片段克隆到pMD19-T载体上,得到重组质粒,测序的结果分别用BLAST进行比较。比较结果显示与其他豆科植物phyA基因的同源性较高,可以证明所得基因就是紫花苜蓿的phyA基因片段,且这两段基因有重合的部分,利用DNAssist2.2基因软件把这两段序列进行拼接,该基因全长3130bp,结果再用BLAST进行比较,得到的结果较好,因此我们可以基本确定这段基因就是紫花苜蓿phyA基因。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 苜蓿秋眠性的研究
• 1.1.1 苜蓿秋眠性的概念
• 1.1.2 苜蓿秋眠性的生理生化特性研究
• 1.1.2.1 温度和光照与秋眠的关系
• 1.1.2.2 秋眠性与光合能力
• 1.2 光敏色素研究进展
• 1.2.1 光敏色素的发现
• 1.2.2 光敏色素的种类和结构
• 1.2.3 光敏色素分子基因及作用方式
• 1.2.3.1 光敏色素基因
• 1.2.3.2 光敏色素的作用方式
• 1.2.4 光敏色素的生理功能
• 1.2.4.1 光敏色素与光周期
• 1.2.4.2 光敏色素对细胞生长的调节
• 1.2.4.3 光敏色素对基因表达的调控
• 1.3 苜蓿生物技术研究进展
• 1.3.1 苜蓿组织培养
• 1.3.2 苜蓿遗传工程
• 1.4 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术
• 1.4.1 RACE 原理
• 1.4.2 RACE 技术的优势
• 1.4.3 RACE 在植物基因克隆上的应用
• 1.4.4 RACE 在植物基因克隆上的发展前景
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 样品、菌株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 实验所用溶液及其配制
• 3.2 RT-PCR 方法的建立
• 3.2.1 引物的设计和合成
• 3.2.1.1 引物设计的思路
• 3.2.1.2 引物的合成
• 3.2.2 紫花苜蓿总RNA 的提取
• 3.2.2.1 提总RNA前的准备工作
• 3.2.2.2 抽提时注意事项
• 3.2.2.3 提取主要步骤
• 3.2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测
• 3.2.3 反转录PCR
• 3.2.3.1 准备工作
• 3.2.3.2 RT 时注意事项
• 3.2.3.3 RT-PCR 具体步骤
• 3.2.4 扩增产物的纯化
• 3.2.5 PCR 产物的测序与序列比对
• 3.3 RACE方法扩增3′端和5′端
• 3.3.1 引物的设计和合成
• 3.3.2 3'RACE 反应
• 3.3.3 5'RACE 反应
• 3.3.4 扩增产物的纯化
• 3.3.5 纯化产物与载体的连接
• 3.3.6 连接产物的转化
• 3.3.7 阳性质粒的筛选与鉴定
• 4 结果
• 4.1 光敏色素A 基因片段的扩增
• 4.1.1 引物设计的依据
• 4.1.2 紫花苜蓿RNA 提取结果
• 4.1.3 紫花苜蓿 PHYA 基因片段的扩增
• 4.1.4 基因片段3′端的扩增
• 4.1.5 重组克隆载体的构建
• 4.1.6 基因片段5′端的扩增
• 4.1.7 重组克隆载体的构建
• 4.1.8 3′端和5′端片段的拼接
• 5 讨论与展望
• 5.1 引物设计的保守性
• 5.2 PCR 体系优化的探讨
• 5.3 RACE 方法扩增基因全长
• 5.3.1 RACE 技术的局限性
• 5.3.2 RACE 步骤的优化和改良
• 5.4 展望
• 6 参考文献
• 附录