用农杆菌浸种法建立白三叶和中华结缕草遗传转化体系的研究

论文摘要

遗传转化是植物遗传改良和基因功能研究的重要工具。利用转基因技术可以冲破物种界限,实现种间遗传育种,并改良现有的物种性状。应用于植物新品种的培育和改良研究,是筛选培育优良品种极为便捷和有效的途径。白三叶和中华结缕草都是品质优良的草种,具有外观优美、适应性强、抗性强、耐践踏、耐刈割、白三叶根系发达,中华结缕草的根状匍匐茎十分发达,都具有很好的保持水土的作用,在园林绿化中应用较多,同时白三叶营养丰富、产草量高是优良的牧草。本研究以白三叶和中华结缕草的萌动种子为转化受体,利用NPT-Ⅱ筛选基因对影响农杆菌介导的遗传转化外部因素进行了深入探索,通过优化转化条件,建立了农杆菌浸种法的遗传转化体系,通过PCR检测初步验证基因已经整合到植物基因组。主要研究结果如下:1.种子发芽实验结果表明,白三叶种子内部细胞分裂活跃期在催芽后的0-3h。20%NaoH浸泡20min处理对中华结缕草种子打破休眠效果较好,其内部细胞分裂活跃期在催芽后的第5-9d。2.通过研究不同卡那霉素浓度及处理时间对种子萌发及植株生长的影响,建立适宜的卡那霉素筛选体系。本研究确定白三叶种子Kan筛选最适浓度为50mg/L,处理时间为为6-8d。中华结缕草种子Kan筛选最适浓度为75mg/L,处理时间为6-10d。3.遗传转化体系优化实验结果表明,适宜白三叶的遗传转化体系为为种子催芽1h,农杆菌菌液OD600为0.9,真空处理,抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min,20℃恒温振荡培养24h,共培养1d;适宜中华结缕草的遗传转化体系为种子催芽6-7d,农杆菌菌液OD600为0.9,真空处理,抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min+抽5im+间歇1min,20℃恒温振荡培养48h,共培养2d。4.以未进行遗传转化的植株作为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,扩增NPT-Ⅱ、GUS基因部分片段。对转化后具有卡那霉素抗性的植株进行PCR检测。检测结果表明部分遗传转化植株扩增出的条带和质粒中的目的条带一致,而未转化植株没有扩增出任何条带,说明目的基因已经整合入植物基因组中。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 综述
• 第一节 植物遗传转化研究进展
• 1.1 遗传转化发展史
• 1.2 转基因植物的检测与鉴定
• 1.3 植物遗传转化的发展前景
• 第二节 遗传转化方法
• 2.1 载体介导转化法
• 2.2 直接转化法
• 2.3 以植物自身细胞为媒介的基因转化法
• 第三节双子叶植物遗传转化研究进展
• 3.1 抗病基因遗传转化
• 3.2 抗虫基因遗传转化
• 3.3 抗逆境基因遗传转化
• 3.4 抗除草剂基因遗传转化
• 3.5 关于品质基因遗传转化研究
• 3.6 展望
• 第四节 单子叶植物遗传转化研究
• 4.1 农杆菌介导单子叶植物的可行性
• 4.2 影响农杆菌介导单子叶植物基因转化效率的因素
• 4.3 单子叶植物获得遗传转化成功的例子
• 4.4 问题与展望
• 第五节 白三叶生物技术研究进展
• 5.1 组织培养
• 5.2 遗传转化
• 5.3 遗传变异研究
• 5.4 展望
• 第六节 中华结缕草生物技术研究进展
• 6.1 组织培养
• 6.2 转基因研究
• 6.3 遗传分化的RAPD 分析
• 6.4 展望
• 第七节 本研究的目的和意义
• 7.1 选题背景与研究意义
• 7.2 主要研究内容
• 7.3 研究的技术路线
• 第二章 用农杆菌浸种法建立白三叶的遗传转化体系
• 第一节 白三叶种子发芽实验
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 发芽率和发芽势测定
• 1.3 发芽过程种子的形态结构观察
• 2 结果与分析
• 2.1 NAA 浸种对白三叶种子发芽的影响
• 2.2 种子萌发过程中的形态结构变化
• 3 小结
• 第二节 卡那霉素筛选实验
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素对白三叶种子萌发的影响
• 2.2 卡那霉素对白三叶幼苗生长的影响
• 3 小结
• 第三节 白三叶遗传转化体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 催芽时间对白三叶转化效率的影响
• 2.2 农杆菌菌液浓度和浸种时间对转化效率的影响
• 2.3 共培养时间对白三叶转化效率的影响
• 2.4 乙酰丁香酮（AS）对转化效率的影响
• 2.5 侵染方式对转化效率的影响
• 3 小结
• 第四节 抗性植株的检测
• 1 材料方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 药品、试剂
• 1.3 植物DNA 的微量提取（CTAB 法）
• 1.4 PCR 检测
• 1.5 GUS 染色
• 1.6 整株PCR 检测
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 叶片检测
• 2.2 GUS 检测
• 2.3 整株PCR 检测
• 3 小结
• 第三章 用农杆菌浸种法建立中华结缕草的遗传转化体系
• 第一节 中华结缕草种子发芽实验
• 1 材料与方法
• 1.1 参试材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同浸种处理对中华结缕草种子发芽势的影响
• 2.2 浸种处理后第20d 种子萌发情况
• 2.3 浸种处理在第30d 种子萌发情况
• 3 小结
• 第二节 卡那霉素筛选实验
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 卡那霉素处理对中华结缕草种子萌发的影响
• 2.1.1 卡那霉素浓度对中华结缕草种子萌发与地上部生长的影响
• 2.1.2 不同卡那霉素浓度对地下部生长的影响
• 2.1.3 不同的卡那霉素处理时间对植株生长的影响
• 2.2 卡那霉素对中华结缕草幼苗生长的影响
• 3 小结
• 第三节 遗传转化体系的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 催芽时间对中华结缕草转化效率的影响
• 2.2 农杆菌浓度对中华结缕草转化效率的影响
• 2.3 侵染时间对中华结缕草转化效率的影响
• 2.4 共培养时间对中华结缕草转化效率的影响
• 2.5 乙酰丁香酮加入量对中华结缕草转化效率的影响
• 2.6 真空处理方式对中华结缕草转化效率的影响
• 3 小结
• 第四节 抗性植株的检测
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 药品、试剂
• 1.3 DNA 提取
• 1.4 PCR 检测
• 1.5 GUS 染色
• 2 结果与分析
• 2.1 PCR 叶片检测
• 2.2 GUS 检测
• 2.3 整株PCR 检测
• 3 小结
• 第四章 讨论
• 4.1 中华结缕草和白三叶种子萌发研究
• 4.2 卡那霉素筛选方法优化
• 4.3 遗传转化体系建立
• 4.3.1 催芽时间
• 4.3.2 农杆菌浓度、侵染时间与共培养时间
• 4.3.3 附加化学物质及侵染方式
• 4.4 转基因植株的检测
• 4.5 本研究的下一步工作
• 第五章 结论
• 5.1 白三叶浸种法遗传转化优化体系
• 5.2 中华结缕草浸种法遗传转化优化体系
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 个人简介
• 导师简介