王鸽α-Syn基因克隆及AVM急性中毒对其在脑组织中表达的影响

论文摘要

α-突触核蛋白（α-Synuclein,α-Syn）是一个由140个氨基酸残基构成的酸性蛋白,在脑组织中高度表达,主要聚集在神经元突触前末梢,在神经元的发育与形成、多巴胺合成、保持突触可塑性及突触囊泡的运输过程中发挥重要作用。相对于哺乳动物,禽类α-Syn的研究相对滞后,而关于王鸽α-Syn基因序列及其在王鸽脑内的分布还未见报道。本研究应用分子生物学技术克隆一段覆盖王鸽α-Syn完整编码区的序列;使用DNAMAN和DNAStar软件对人、黑猩猩、牛、猪、王鸽、原鸡、斑胸草雀及小鼠8种物种α-Syn cDNA编码区核苷酸和氨基酸序列进行比对,并构建生物进化树;利用基因工程技术在原核表达系统中表达了α-Syn并制备了多克隆抗体;应用免疫组化方法检测了王鸽脑组织中α-Syn的分布及阿维菌素（Avermectin,AVM）急性中毒对王鸽脑组织中α-Syn蛋白表达的影响,结果表明:1成功克隆了613 bp的王鸽α-Syn cDNA序列,其中包括ORF 432 bp,起始密码子ATG,终止密码子TGA,5′UTR区域16 bp,3′UTR区域165 bp,王鸽α-Syn由143个氨基酸残基组成,蛋白分子量为14.9 kDa。2王鸽与其他7个物种α-Syn编码区核苷酸序列同源性在81.71%93.52%之间,与原鸡和斑胸草雀同源性最高均为93.52%,与黑猩猩的为83.80%,与人的为83.60%,与猪的为83.56%,与小鼠的为82.87%,与牛的为81.71%,王鸽与其他7种物种α-Syn氨基酸序列的同源性在83.22%97.20%之间,说明不同物种间α-Syn基因高度保守,提示王鸽与其他已知物种α-Syn的功能相似。3在大肠杆菌表达系统中成功表达了pGEX6p-1-α-Syn融合蛋白,制备出兔抗王鸽α-Syn的多克隆抗体,采用间接ELISA检测抗体的效价为1:51 200,采用Western blot检测出多克隆抗体对于融合蛋白具有特异性。4王鸽海马、丘脑、嗅球、视叶、小脑5个部位中均检测到α-Syn,含量高低依次为海马、嗅球、丘脑、视叶和小脑,表明α-Syn在王鸽脑内分布广泛,并且分布具有差异性。5 AVM急性中毒后,王鸽海马、丘脑、嗅球、视叶和小脑5个部位中α-Syn蛋白表达均升高,海马、丘脑和嗅球的α-Syn表达与对照组相比差异显著（P<0.05）,而视叶和小脑与对照组相比差异不显著（P>0.05）,表明AVM急性中毒后,脑不同部位α-Syn表达量的升高具有差异性,提示AVM急性中毒引起的神经损伤与α-Syn表达增加有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 α-Syn 的结构和功能
• 1.2 α-Syn 与神经退行性疾病
• 1.3 环境毒物对α-Syn 的影响
• 1.3.1 农药对α-Syn 的影响
• 1.3.2 金属离子对α-Syn 的影响
• 1.4 α-Syn 的检测方法
• 1.5 AVM 毒理学研究进展
• 1.6 鸽子作为实验动物的意义
• 1.7 本试验目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂
• 2.1.1 主要的菌株与载体
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验动物及分组
• 2.3.1 实验动物饲养与处理
• 2.3.2 实验材料采集
• 2.4 引物设计与合成
• 2.5 王鸽α-Syn 基因序列的克隆
• 2.5.1 脑组织中总RNA 的抽提
• 2.5.2 总RNA 含量与纯度检测
• 2.5.3 反转录反应
• 2.5.4 王鸽α-Syn 基因PCR 扩增及鉴定
• 2.5.5 王鸽α-Syn 基因PCR 产物的胶回收
• 2.5.6 王鸽α-Syn 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析
• 2.5.7 王鸽α-Syn 基因 3′-UTR 克隆
• 2.6 王鸽α-Syn 基因重组表达载体的构建与鉴定
• 2.6.1 王鸽α-Syn 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析
• 2.6.2 王鸽α-Syn 原核表达载体的构建
• 2.6.3 王鸽α-Syn 重组表达菌的诱导表达
• 2.6.4 重组融合蛋白王鸽α-Syn 的SDS-PAGE 鉴定
• 2.6.5 重组融合王鸽α-Syn 蛋白的纯化
• 2.7 抗王鸽α-Syn 多克隆抗体的制备和鉴定
• 2.7.1 抗原乳化
• 2.7.2 动物接种
• 2.7.3 抗血清的收集
• 2.7.4 王鸽α-Syn 多克隆抗体效价测定
• 2.7.5 王鸽α-Syn 多克隆抗体特异性的鉴定
• 2.8 王鸽脑组织中α-Syn 含量的免疫组化检测
• 2.8.1 载（盖）玻片的处理
• 2.8.2 石蜡切片的制作
• 2.8.3 PV 免疫组化二步法
• 2.8.4 结果判定
• 2.9 数据统计与分析
• 3 结果与分析
• 3.1 王鸽α-Syn 基因克隆与测序结果
• 3.1.1 王鸽脑组织中总RNA 的提取与鉴定
• 3.1.2 王鸽α-Syn 基因的PCR 扩增结果
• 3.1.3 王鸽α-Syn PCR 产物胶回收结果
• 3.1.4 王鸽α-Syn 基因序列的测序结果
• 3.1.5 王鸽α-Syn 基因编码区分析结果
• 3.1.6 α-Syn 的3′RACE 反应结果
• 3.2 重组表达载体的构建与鉴定
• 3.2.1 目的片段与载体双酶切结果
• 3.2.2 融合蛋白的表达、鉴定与纯化结果
• 3.3 多克隆抗体的制备和鉴定结果
• 3.3.1 间接ELISA 法测定多克隆抗体效价的结果
• 3.3.2 Western blot 检测结果
• 3.4 免疫组化方法检测α-Syn 基因在王鸽脑内的分布规律
• 3.4.1 免疫组化方法优化选择
• 3.4.2 α-Syn 在王鸽脑不同部位的表达
• 3.5 王鸽AVM 急性中毒临床表现及α-Syn 在脑不同部位表达量的变化
• 4 讨论
• 4.1 王鸽α-Syn 基因克隆
• 4.1.1 王鸽α-Syn 基因编码区及同源性分析
• 4.1.2 王鸽α-Syn 3′UTR 克隆
• 4.2 重组王鸽α-Syn 蛋白表达条件优化
• 4.3 王鸽α-Syn 多克隆抗体的制备
• 4.4 α-Syn 在王鸽脑不同部位的分布
• 4.4.1 免疫组化方法的建立和优化
• 4.4.2 α-Syn 在王鸽脑中的分布
• 4.5 AVM 急性中毒对 α-Syn 表达的影响
• 4.5.1 AVM 急性中毒的临床表现
• 4.5.2 AVM 急性中毒对 α-Syn 表达的影响
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的学术论文