一、大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的初步研究（论文文献综述）
张红超[1]（2021）在《102例犬细菌性角膜溃疡的流行病学调查及手术对深层角膜溃疡的疗效观察》文中进行了进一步梳理角膜溃疡（Cornea Ulceration）是兽医临床较常见的眼科疾病,其病原菌主要为伪中间葡萄球菌（Staphylococcus Pseudintermedius）。目前,治疗角膜溃疡的方法是药物治疗和药物治疗联合手术治疗,如联合带蒂板层角膜移植手术或带蒂结膜瓣遮盖术。但是,对这两种手术的临床疗效比较没有系统的研究。本研究首先对郑州地区102例角膜溃疡犬进行流行病学分析,然后依据流行病学调查情况,用主要致病菌构建犬角膜溃疡模型,进而观察带蒂板层角膜移植术和带蒂结膜瓣遮盖术对角膜溃疡的疗效。现将研究情况报告如下:试验一:102例犬角膜溃疡的流行病学调查及细菌的分离鉴定与耐药性分析收集2017年6月至2019年12月间郑州市三家宠物医院收治的102例犬角膜溃疡病例,统计其发病原因、年龄、性别、品种、治疗方法及预后等,并使用无菌生理盐水浸湿的细胞刷蘸取溃疡灶样品,对采集的样品进行细菌培养与纯化,然后使用MALDI Biotyper系统对分离的菌株进行鉴定。同时,将所分离的主要菌株做眼科常用药物的敏感性试验。试验结果如下:（1）发病率较高的品种为贵宾、比熊、京巴、柯基和混血犬;年龄从2月龄至19岁不等,平均年龄为5.8±0.54岁,发病原因主要以外伤（22例,21.57%）和干眼症（14例,13.73%）为主。（2）细菌培养阳性99例,以伪中间葡萄球菌感染的混合感染病例为主;体外抑菌有效的抗生素有头孢甲肟（96.94%）、利福平（98.98%）、妥布霉素（97.96%）、左氧氟沙星（93.88%）和环丙沙星（96.94%）;而对四环素（91.84%）、红霉素（96.94%）和氯霉素（51.02%）有耐药性。试验二:不同治疗方法对伪中间葡萄球菌性犬角膜溃疡的疗效观察选用15只健康成年比格犬,使用微量注射器吸取伪中间葡萄球菌菌液注入角膜基质层内构建犬角膜溃疡模型。造模后48 h,使用0.5%聚维酮碘生理盐水溶液对溃疡灶进行冲洗。同时滴加氧氟沙星滴眼液和玻璃酸钠滴眼液12次/d,两种药物用药间隔为1 min。造模成功后,随机选择3只犬用于抗生素治疗组,12只犬用于抗生素联合手术治疗组,手术治疗组在术眼消毒后进行手术治疗,其中左眼行带蒂板层角膜移植术,右眼行带蒂结膜瓣遮盖术。并于术后7、14、21、28、35和42 d统计相关临床指标和信息。根据临床观察指标和症状进行评分。试验结果如下:（1）单纯抗生素治疗组实验犬在治疗后36-46h内均出现角膜穿孔,前房塌陷,虹膜脱出,羞明,流泪,眼分泌物增多;角膜大面积水肿、不透明,多象限内可见新生血管。单纯抗生素治疗组治疗无效。（2）手术治疗组角膜浑浊度评分:术前两组间无统计学差异（p>0.05）;术后7、14和21 d带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着高于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）;术后28d,两组间无统计学差异;术后35和42d,带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着低于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）。（3）手术治疗组角膜新生血管评分:术前及术后7d,两组间无统计学差异（p>0.05）;术后14、21、28和35d,带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着高于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）;术后42d,两组间无统计学差异（p>0.05）。（4）手术治疗组角膜水肿面积评分:术前两组间无统计学差异（p>0.05）;术后7和14 d,带蒂板层角膜移植组评分显着或极显着高于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01或p<0.05）;术后21、28、35和42d,两组间无统计学差异（p>0.05）。（5）手术治疗组泪液量检测结果:术前及术后2-6d,两组间无统计学差异（p>0.05）;术后8-18、32、38和42d,带蒂板层角膜移植组评分极显着低于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01）;在其余时间点,两组间无统计学差异（p>0.05）。（6）手术治疗组眼内压检测结果:术前及术后2-6d,两组间无统计学差异（p>0.05）;术后8-18、32、38和42 d,带蒂板层角膜移植组评分极显着低于带蒂结膜瓣遮盖组（p<0.01）;在其余时间点,两组间无统计学差异（p>0.05）。试验三:不同治疗方法对伪中间葡萄球菌性角膜溃疡犬角膜组织病理学及相关细胞因子表达的影响将抗生素联合手术治疗组的12只实验犬随机分成四组,分别于术后14、28、35和42 d进行手术采取角膜。将采集的角膜沿手术位置一分为二,一半用于组织切片制作,一半用于荧光定量检测细胞因子。试验结果如下:（1）单纯抗生素治疗组的组织病理学变化:角膜上皮层缺失,结构不完整,内皮细胞层部分区域缺失,后弹力层缺失。溃疡灶内可见新生肉芽组织,但无法完全闭合溃疡灶。（2）手术治疗组的组织病理学变化:带蒂板层角膜移植组角膜结构完整,角膜上皮层重新上皮化,纤维蛋白排列整齐有序,后弹力层和内皮层结构完整。带蒂结膜瓣遮盖组溃疡灶处完全覆盖结膜上皮,细胞密度高,排列杂乱无章,基质层可见新生血管,纤维蛋白排列无序。后弹力层和内皮层结构完整。（3）炎性因子基因表达的变化:术后14和28 d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中TLR2、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA相对表达量极显着升高（p<0.01）;术后35d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中TLR2和TNF-α的mRNA相对表达量极显着升高（p<0.01）,其余炎性因子基因表达量在两组间无统计学差异（p>0.05）;术后42d,两组各炎性因子基因表达量无统计学差异（p>0.05）。（4）生长因子基因表达的变化:术后14 d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中VEGF、FGF和TGF的mRNA相对表达量均显着或极显着升高（p<0.05或p<0.01）。术后28d,两组各细胞因子的mRNA相对表达量无统计学差异（p>0.05）。术后35和42 d,与带蒂结膜瓣遮盖组相比,带蒂板层角膜移植组中TGF的mRNA相对表达量显着降低（p<0.05）,其余生长因子的mRNA相对表达量无统计学差异（p>0.05）。试验四:带蒂板层角膜移植术对犬深层角膜溃疡临床病例的疗效观察对犬深层角膜溃疡临床病例采取带蒂板层角膜移植术后,连续观察至60 d。术后泪液量均在正常值范围内波动,眼内压在术后5-11 d内低于正常值范围,其余时间点均在正常值范围内。没有病例出现重复感染,术后恢复效果良好,视力均得到恢复。综上所述,郑州市102例犬角膜溃疡病例中的犬品种多为泰迪和短头颅犬,感染的细菌主要为伪中间葡萄球菌且对红霉素、氯霉素和四环素类药物耐药;板层角膜移植手术的术后恢复效果优于结膜瓣遮盖术,角膜愈合与透明度良好,纤维蛋白排列整齐有序,上皮层结构完整。
李建德[2]（2021）在《小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究》文中研究指明眼角膜暴露于外部环境,极有可能受到各种损伤。角膜化学损伤占眼科急诊的11.5%至22.1%,其中,碱烧伤通常比其他类型的损伤更严重,这是由于碱试剂亲脂性的特征使其能迅速穿透组织,造成更为严重的创伤。即使采取及时的临床治疗,大多也会由于伤口愈合过程中形成角膜瘢痕和新生血管而造成永久性失明。因此,角膜的碱烧伤修复不仅是基础科学研究的热点,也是一个急需解决的重要医学问题。然而,大量的研究多集中在药物对角膜碱烧伤的影响上,对损伤引起的系统性应答机制研究较少,不利于靶点药物的筛选。角膜碱烧伤引发的应答是一个复杂的级联反应,涉及细胞因子介导下的角膜上皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的相互作用,其中最为重要的是损伤引起的角膜血管新生、纤维化和严重的炎症反应。近年来,雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）被发现具有抗角膜损伤引起的纤维化和血管生成作用,但其介导哺乳动物雷帕霉素靶点（Mammalian target of Rapa,m TOR）调节角膜血管新生的机制研究甚少。本研究通过建立小鼠角膜碱烧伤模型,采用Hematoxylin&Eosin（H&E）染色、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、亚硫酸氢钠测序PCR（Bisulfite sequencing PCR,BSP）、电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）、流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）技术,从形态、组织和分子水平,确定小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控机制、转录因子调控机制、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控机制、以及角膜碱烧伤引起的机体免疫应答与药物干预下的修复机制,得到以下结论:Ⅰ.碱烧伤引起的小鼠角膜浑浊化及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控、转录因子调控、及MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控:1.碱烧伤引发血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）介导的血管新生,并诱导静止的角质细胞分化为成纤维细胞,成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）转化为肌成纤维细胞导致角膜纤维化。Rapa通过降低VEGF和α-SMA介导的血管生成和角膜纤维化,减轻角膜碱烧伤引起的损伤。2.碱烧伤诱导的角膜细胞增殖主要来自于基质细胞,而Rapa诱导的损伤角膜细胞增殖主要来自于上皮细胞。此结果显示出Rapa作为治疗角膜碱烧伤备选药物的可行性:能有效促进损伤角膜上皮细胞的增殖以达到修复创伤面的目的,并可能抑制因损伤引起的基质细胞增殖,保证了角膜基质的均一性和良好的光线折射性。3.小鼠角膜碱烧伤可诱导DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferases 3b,Dnmt3b）表达升高并介导m TOR基因启动子发生从头DNA甲基化修饰,而Rapa通过抑制Dnmt3b的表达降低碱烧伤诱导的甲基化。这种调控机制在如碱烧伤类的损伤中主要借助于基因启动子区一些关键的Cp Gs位点实现其对转录水平的影响。4.转录因子ETS变体5（The transcription factor ETS-variant 5,ETV5）结合在Rapa诱导的m TOR基因去甲基化位点并负调控基因表达,在角膜碱烧伤后的Rapa修复中发挥重要作用。5.小鼠角膜碱烧伤模型中,损伤诱导PI3K/AKT/m TOR信号通路活化和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α）高调,引起VEGF高表达。因此得到一条角膜碱烧伤引起的血管生成调控轴:PI3K/AKT/m TOR/HIF-1/VEGF。6.MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路通过m TOR分子调控VEGF的表达,因此,对以上通路的联合抑制,有利于血管生成疾病的治疗。Ⅱ.小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下的免疫应答:1.角膜碱烧伤引起包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的白细胞浸润,它们通过角膜缘迁移进入基质,释放白介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）,启动Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）和NOD样受体家族3（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3）炎症信号通路,招募基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinases-2,MMP-2）,发展了损伤角膜的急性炎症反应和与之相关的血管生成。Rapa通过抑制白细胞的浸润和炎症因子的表达降低了碱烧伤引起的角膜炎症反应和炎症相关的血管生成。2.Rapa促进角膜中碱烧伤诱导的CD4+T细胞向CD4+CD25high Treg细胞转化。
杨雪[3]（2020）在《血浆纤维蛋白膜负载骨髓间充质干细胞与角膜上皮细胞用于大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究》文中研究说明据世界卫生组织估计,全球有490万人患有双侧角膜盲,单侧角膜盲的患病人数约为2300万人。对于严重的角膜损伤,进行角膜移植是目前最有效的治疗手段。但全世界捐赠角膜数量有限,解决这种短缺的方法之一便是使用组织工程化全部或部分厚度的角膜移植物。组织工程种子细胞来源多为干细胞,其中骨髓间充质干细胞（Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）来源广泛,使用方便,且免疫原性低,为种子细胞的首选。现阶段在角膜损伤的治疗中多使用生物相容性好的羊膜作为支架材料来负载干细胞。目前研究中已发现通过体外间接接触共培养的方式BMSCs可以向角膜上皮细胞分化,但在使用BMSCs治疗角膜损伤时,受到早期损伤部位微环境的影响,BMSCs在损伤部位很难存活;使用羊膜作为支架材料面临材料来源有限,成本较高的问题。为解决以上问题,本课题进行了以血浆纤维蛋白膜为支架负载BMSCs与角膜上皮细胞,作为组织工程角膜植片,对角膜损伤修复的实验研究。研究工作主要包括以下内容:1大鼠BMSCs及角膜上皮细胞的分离培养与鉴定采用全骨髓贴壁法提取大鼠BMSCs,体外培养贴壁生长,呈梭形,排列呈旋涡状,具有方向性;流式细胞术检测发现,所提取的大鼠BMSCs表面抗原CD90呈阳性,CD34呈阴性,与文献报道一致。采用酶消化法对大鼠角膜上皮细胞进行分离提取,细胞贴壁生长,呈多角形,免疫荧光结果显示所提取的细胞表达角膜上皮细胞的特异性蛋白CK12。2角膜上皮细胞对接触共培养BMSCs的诱导分化使用CFSE对BMSCs进行标记,然后将BMSCs与角膜上皮细胞按照1:3、1:1、3:1的比例进行7天接触共培养。然后,流式细胞术分选出BMSCs后,采用qRT-PCR检测BMSCs中角膜上皮细胞相关基因p63、CK12的mRNA水平。结果显示,原本不表达p63、CK12基因的BMSCs在与角膜上皮细胞进行接触共培养后表达这两种角膜上皮细胞相关基因,且随着共培养体系中角膜上皮细胞比例的升高,BMSCs中这两种角膜上皮细胞相关基因的表达量均上升。这一结果表明受直接接触共培养的角膜上皮细胞诱导BMSCs呈现向角膜上皮细胞分化的改变,且共培养体系中角膜上皮细胞的比例影响BMSCs的分化程度。3血浆纤维蛋白膜的制备与性能检测3.1制备通过颈静脉窦取血获得大鼠全血,离心后取上层血浆,加入Ca2+促凝后获得血浆凝胶,压缩除去凝胶内多余液体后冻干,获得血浆纤维蛋白膜。3.2扫描电镜观察膜片结构扫描电镜检测发现,血浆纤维蛋白膜片表面微孔分布较为均匀,孔径大小多分布在25～30μm,多孔结构有利于细胞附着与及营养物质的运输。3.3流变仪检测所制膜片粘弹性对冻干复水的膜片与新鲜膜片分别进行流变学检测,结果显示二者的弹性模量G’均大于粘性模量G",且冻干复水膜片的G’与G"均大于新鲜膜片。这一结果表明冻干后复水的血浆纤维蛋白膜相较新鲜膜片有着更好的粘弹性,不易发生形变,即刚度更高,负载细胞后将其用于移植治疗时操作更便利。3.4扫描电镜观察血浆纤维蛋白膜上细胞负载情况将分离培养的BMSCs和角膜上皮细胞接种于冻干复水的血浆纤维蛋白膜上,培养24h后,采用超临界干燥技术获得负载细胞的干燥膜片。对其进行扫描电镜观察,发现两种细胞均存在于膜片表面,表明所制备的血浆纤维蛋白膜片可以用做负载细胞的支架。4血浆纤维蛋白膜片负载BMSCs及角膜上皮细胞对大鼠角膜碱烧伤的治疗4.1对大鼠碱烧伤后角膜损伤愈合情况的影响利用荧光素钠染色法检测了在角膜碱烧伤3、7天时大鼠角膜上皮损伤的愈合情况。结果发现,随着损伤后天数的增加,损伤组、空白膜片组与负载细胞膜片组的大鼠角膜上皮缺损率均有不同程度的减少;在3天和7天,角膜上皮细胞的缺损率均为损伤组>空白膜片治疗组>负载细胞的膜片治疗组,且各组之间的上皮缺损率均有显着性差异（p<0.0001）。在角膜碱烧伤后第7、14天对角膜损伤部位进行了 HE染色观察,结果发现随着天数的增加,三组大鼠角膜损伤部位的上皮及基质结构都有着不同程度的恢复,其中空白膜片组与负载细胞膜片组角膜损伤部位结构恢复更好,后者角膜损伤部位结构恢复最好,在第14天时已接近正常角膜结构。这一结果表明,使用自制负载细胞膜片可以有效促进角膜损伤的愈合。4.2对大鼠碱烧伤后炎症反应的影响采用免疫荧光染色方法检测了大鼠角膜碱烧伤后7天、14天角膜组织中基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9,MMP-9）,金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1,TIMP-1）,白介素-6(（Interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）的表达。结果发现,第7天和第14天负载细胞的膜片治疗组与空白膜片治疗组角膜中,这四种炎症相关因子的表达相较于损伤组都有着不同程度的减少,负载细胞的膜片治疗组角膜中这些炎症相关因子的表达最少。这说明纤维蛋白膜片可以减轻大鼠角膜碱烧伤后炎症反应,在膜片负载细胞后对炎症的抑制效果更好。4.3对大鼠碱烧伤后角膜纤维化的影响采用免疫荧光染色方法检测了大鼠角膜碱烧伤后第7天、第14天角膜组织中平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin,α-SMA）的表达。结果表明,第7天和第14天负载细胞的膜片治疗组与空白膜片治疗组角膜中α-SMA的表达相较于损伤组都有着明显的减少,负载细胞的膜片治疗组角膜中α-SMA的表达最少。这说明纤维蛋白膜片可以抑制大鼠角膜碱烧伤后的角膜纤维化,在膜片负载细胞后抑制角膜纤维化的作用更强。4.4负载BMSCs及角膜上皮细胞的血浆纤维蛋白膜片中BMSCs在大鼠角膜碱烧伤部位的分化与植入利用 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-1-（2-deoxy-β-D-ribofuranosyl）uracil5-Bromouracil deoxyriboside,5-BrdU）标记对 BMSCs 进行示踪以检测 BMSCs 在损伤角膜组织的植入情况。结果显示,在第7天没有在角膜损伤部位检测到BMSCs,但在第14天时在角膜损伤部位检测到有少量BMSCs,且免疫荧光染色后发现BMSCs表达CK12。这表明以血浆纤维蛋白膜支架以及负载的角膜上皮细胞组成的微环境下,BMSCs在早期修复阶段（7～21天）可以植入到损伤部位,并能够向角膜上皮细胞分化。总之,本课题将BMSCs与角膜上皮细胞装载于自制的血浆纤维蛋白膜支架上制备了组织观察细胞膜片,移植用于大鼠角膜碱烧伤时,显示出有效减轻角膜损伤部位炎症反应,抑制角膜损伤部位的纤维化程度,加快角膜伤口愈合的作用,还发现部分BMSCs成功植入大鼠角膜损伤部位并向角膜上皮细胞分化。这些结果提示,该组织工程细胞膜片值得进一步研究,或有望为角膜损伤提供新的治疗方案,为构建组织工程角膜提供新的组合方式。
马进海[4]（2020）在《卡替洛尔对大鼠角膜新生血管抑制作用的实验研究》文中研究说明目的:用活体共聚焦显微镜（IVCM）观察正常SD大鼠角膜各层结构特点,获取正常SD大鼠角膜共聚焦基础数据;建立大鼠碱烧伤CNV模型,观察碱烧伤后CNV的增值过程;观察不同浓度实验药物（1%和2%卡替洛尔滴眼液）对大鼠CNV的抑制作用,为角膜新生血管性疾病的治疗提供新的药物选择。方法:选取49只体重（200±20）g健康成年（6-8周龄）清洁级雄性SD大鼠,实验前于裂隙灯下检查,排除角膜病变,然后采用完全随机化方法选取10只作为空白对照组（A组）,麻醉后行前节照相和角膜共聚焦显微镜检查;余39只建立角膜碱烧伤模型,建模时用打孔器制作直径为3mm圆形滤纸片,所有建立角膜碱烧伤模型眼均为右眼,建模后左氧氟沙星滴眼液点眼,4次/日,连用3天。第4日选取建模成功且新生血管生长相对均一的大鼠30只,继续采用完全区组随机化分组方法随机分为三组:阴性对照组（B组）,1%卡替洛尔组（C组）,2%卡替洛尔组（D组）;第4-17日分别给与B组（生理盐水点眼,2次/日）、C组（1%卡替洛尔,2次/日）、D组（2%卡替洛尔,2次/日）;分别于建模第1、4天,用药第4、6、12、14天对各组大鼠进行前节照相和角膜IVCM检查,记录检查结果,计算各组角膜新生血管评分、角膜水肿评分、角膜新生血管面积,计算角膜上皮、基质、炎性细胞以及内皮细胞计数,读取各组角膜厚度,完成实验结果统计分析。结果:正常SD大鼠散瞳后前节照相可见瞳孔规则圆形散大,角膜透明,周边虹膜清晰可见,晶状体无明显混浊,角巩膜缘血管无扩张及充盈;IVCM检查可见角膜上皮细胞边界高反射、胞质呈低反射信号,角膜上皮细胞计数为:5267±125个/mm2。角膜基质层有纤维束样和星芒状两种形态,有时可见两种结构并存;大鼠角膜基质浅层神经纤细迂曲,基质深层神经较粗,走行较直;角膜基质细胞核呈类圆形高反射信号,正常大鼠此细胞计数为:74±10个/mm2;大鼠角膜内皮细胞边界低反射、胞质呈高反射信号,多为较规则多边形,此细胞计数为:3377±279个/mm2;角膜厚度为:145.5±9.2um。建模后眼前节照相结果:建模第4天角巩膜缘可见毛刷状新生血管;角膜新生血管评分、水肿评分及新生血管面积均表现为阴性对照组高于卡替洛尔组,且存在差异（各组均为P<0.05）。建模组CNV面积均在建模第14天达到峰值,生理盐水组为20.91±1.68mm2,1%卡替洛尔组为11.15±1.45mm2,2%卡替洛尔组为10.83±1.28mm2;角膜IVCM检查结果:建模第4天基质层可见CNV长入,第14天基质层CNV生长最密,管径粗大,相互交通,血流信号丰富。角膜上皮细胞及内皮细胞计数空白对照组最高,分别为5267±125个/mm2、3377±279个/mm2,建模组这两项计数下降,且差异显着（P值均为0.000）,与生理盐水组相比,2%卡替洛尔干预可减轻角膜上皮细胞计数的下降及内皮细胞计数的下降,两组P值分别为0.039、0.000,1%卡替洛尔干预可减轻角膜内皮细胞计数的下降（P值值为0.03）;角膜基质细胞及炎性细胞计数建模当天出现升高,分别于建模第7、4天达到峰值,卡替洛尔干预可显着降低基质细胞（两组P值均为0.000）及炎性细胞（两组P值分别为0.003、0.001）计数;正常SD大鼠角膜厚度为:145.5±9.2um,碱烧伤后角膜厚度存在差异（P=0.000）,两两比较,生理盐水组角膜厚度增加无统计学意义（P=0.062）,而生理盐水组与卡替洛尔组相比,存在显着差异（P值均为0.002）,卡替洛尔组与空白对照组无差异（P值均为1.000）,单独分析用药12天及14天时角膜厚度发现,卡替洛尔可使角膜厚度变薄,且存在显着差异（P值分别为0.000、0.003）。以上所有统计指标显示1%卡替洛尔组与2%卡替洛尔组之间无统计学差异（各组P值均大于0.05）。结论:卡替洛尔滴眼液抑制CNV有效;活体共聚焦显微镜（IVCM）检查能够清晰显示正常SD大鼠角膜结构特点,并可对角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞进行计数;活体共聚焦显微镜（IVCM）检查能清晰显示SD大鼠角膜碱烧伤后不同阶段的活体组织病理变化;卡替洛尔滴眼液可能通过抑制角膜炎性细胞浸润、减轻角膜水肿、改善角膜神经损伤、减轻角膜上皮及内皮细胞的破坏、抑制基质细胞增值来发挥抗新生血管作用;本实验中1%和2%卡替洛尔滴眼液均可抑制CNV生长,两者疗效无差异。
王剑超,穆廷魁,胡笳,刘子瑶,姚亮,秦莉[5]（2020）在《贝伐单抗抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管及淋巴管》文中认为目的观察角膜缝线诱导的大鼠角膜新生血管和新生淋巴管生成情况及贝伐单抗（bevacizumab）结膜下注射对其生成的抑制作用。方法将55只大鼠分为三组:对照组（3只大鼠6只眼,不缝线）,生理盐水组（26只大鼠26只眼,角膜缝线后结膜下注射生理盐水0. 05 ml）及贝伐单抗组（26只大鼠26只眼,角膜缝线后结膜下注射贝伐单抗0. 05 ml）。分别于术后第4,7,10,14天测量术眼角膜新生血管面积,HE染色检测角膜炎症反应情况,免疫组化染色检测VEGF-C及CD31蛋白表达,电镜观察角膜新生血管及淋巴管形成情况。结果与生理盐水组相比,贝伐单抗组术后角膜新生血管面积明显较小（P<0. 05）。大鼠角膜缝线后VEGF-C及CD31蛋白表达的积分光密度值（intergral optical density,IOD）,贝伐单抗组较生理盐水组降低（P <0. 01）;大鼠角膜缝线后VEGF-C及CD31蛋白表达的IOD值在术后14 d时,贝伐单抗组与对照组相比,差异无统计学意义（P> 0. 05）。透射电镜下可见贝伐单抗组角膜新生血管及淋巴管出现较晚,淋巴管密度较低。结论贝伐单抗能够减少大鼠角膜缝线后早期新生血管及淋巴管形成,其抑制淋巴管形成的机制可能是阻断VEGF-C/VEGFR-3信号传导通路。
王玮玮[6]（2019）在《基质透镜植入治疗圆锥角膜及角膜基质替代物的可行性研究》文中进行了进一步梳理目的圆锥角膜（Keratoconus,KC）是一种常见的非炎症性扩张性角膜病,以进行性变薄、前凸为特征,导致视力逐渐下降,出现不规则散光,甚至发生角膜水肿、瘢痕等。为了探讨圆锥角膜治疗的新思路,本研究针对其进行性变薄、前凸的特征性临床表现,利用飞秒激光辅助透镜植入术后再行角膜交联术,探究该手术方式的安全性及能否有效延缓圆锥角膜进展等。同时,由于目前基质透镜的来源和形态局限,本研究进一步探究异种生物角膜基质透镜和生物打印3D角膜透镜作为新型基质替代物的可行性,有助于圆锥角膜手术方案的个性化设计,进一步提升患者的视力。方法回顾性分析2016年3月至2016年12月间,于我院接受飞秒激光辅助透镜植入术后行角膜交联术的患者,于我院仅接受角膜交联术且随访时间至少2年的患者,收集一般资料、视力及屈光状态、角膜厚度及曲率和其他眼科检查结果,对两组内术后与术前、两组之间分别进行比较,探究飞秒激光辅助透镜植入术后角膜交联术是否能延缓圆锥角膜进展,与仅角膜交联术相比治疗效果是否有差异。本研究取巴马小型猪、SD大鼠、人基质透镜作为异种透镜,并与浙江大学工程学院合作获得生物打印基质透镜,将4种透镜分别植入新西兰白兔的角膜基质袋中,收集裂隙灯检查、眼前节OCT及病理切片结果,观察异种透镜（术后6月短中期）及生物打印透镜（术后1月短期）的生物相容性,是否会产生排斥反应,探究异种及生物打印透镜作为基质替代物的可行性。结果回顾性分析共35眼纳入分析,其中飞秒激光辅助透镜植入术后角膜交联术（透镜植入+交联组,L-CXL）共9眼,仅接受角膜交联术且随访时间至少2年的（交联组,CXL）共26眼。两组患者角膜厚度均<500um。L-CXL组术后3月开始与术前相比,等效球镜显着增加且与交联组存在组间差异;最佳矫正视力无显着变化,但与交联组存在组间差异;角膜厚度、前表面K值、Kmax显着增加,且与交联组存在组间差异,后表面K值无显着变化;内皮细胞密度均无明显变化。术后21月随访显示,交联组与术前各参数均无显着性差异。异种角膜基质透镜术后1月、3月、6月分别观察结果显示:裂隙灯检查均角膜透明,未见细胞浸润;眼前节OCT可见植片在位,角膜形态可,无明显疤痕化纤维增生或细胞浸润;HE染色均与阴性对照组无明显差异,纤维排列可,植片植床贴合可;免疫组化除猪角膜自身Ⅰ型胶原蛋白表达较兔高外,α-平滑肌肌动蛋白、Ⅰ型胶原蛋白、细胞纤连蛋白表达均与阴性对照组无明显差异。生物打印3D透镜术后1月内短期观察结果显示:裂隙灯检查均角膜透明,未见细胞浸润;眼前节OCT可见植片密度近房水,无明显降解,交界处可见轻度疤痕化。结论飞秒激光辅助透镜植入后角膜交联术能有效提高角膜厚度、阻止圆锥进展,但不优于单独角膜交联术,且会进一步加重屈光不正。异种透镜可以作为角膜基质替代物,生物打印透镜仍需进一步观察。
袁晔[7]（2015）在《兔骨髓间充质干细胞膜片对角膜化学烧伤的治疗作用与机制研究》文中认为研究目的:一.探讨体外分离培养兔骨髓间充质干细胞的可行性;构建骨髓间充质细胞膜片;观察细胞膜片超微结构;二.探讨骨髓间充质干细胞培养基上清液对体外培养角膜基质细胞生长的影响,分析其产生影响的原因;三.探讨骨髓间充质干细胞膜片对兔角膜化学烧伤动物的治疗效果,检测治疗过程中相关细胞因子的表达水平;探讨细胞膜片发挥治疗作用的机制。研究方法:一.贴壁筛选分离和体外培养幼兔骨髓细胞,对所得细胞进行细胞传代培养、纯化;倒置显微镜下细胞形态学观察,照相,对比不同浓度条件接种细胞的培养效果;细胞诱导分化试验行成脂和成骨诱导并鉴定,观察骨髓间充质干细胞的分化能力;细胞表面标记CD29、CD44、CD45检测鉴定细胞,观察所获细胞其纯度;检测骨髓间充质干细胞克隆形成能力;维生素C诱导体外培养兔骨髓间充质干细胞多层生长,构建骨髓间充质干细胞细胞膜片,HE染色行细胞膜片组织学鉴定。扫描电子显微镜、透射电子显微镜观察培养好的BMSCs膜片,观察组织成分、细胞状态;ELISA方法检测不同浓度细胞体外培养液上清液中IL-2、MMP-9、VEGF、IL-10、TSP-1和TSG-6等细胞因子表达量。二.兔角膜基质细胞分离和培养至对数生长期,应用无血清DMEM（Serum-free FCM）、含10%FBS DMEM的培养液（FCM）和BMSC上清液（MSC medium）培养角膜基质细胞,应用MTT、划痕实验、细胞周期检测三种培养液的影响,ELISA检测三种条件下IL-2、IL-10、TSP-1和TSG-6四种细胞因子表达量。三.新西兰大白兔72只,成功建立角膜化学烧伤模型后,随机分为实验组、对照组,术后7天、14天、21天,应用裂隙灯显微镜观察上皮完整性、基质透明性及血管新生情况,观察拍照后每个时间点随机按3只实验动物一组取材,分别进行2westernblot检测vegf,mmp-9,il-2和s100a8等因子,rt-pcr、elisa检测egf、mmp-9、s100a8、il-2、tsp-1、tsg-6和il-10等因子、组织切片行he染色和免疫荧光检测细胞因子表达。研究结果:第一部分1.1角膜间充质干细胞成功构建细胞膜片;bmscs原代培养24h全量换液效果佳。第三代细胞,获得较纯化的bmscs,细胞边缘折光性好,可用于后续试验;成脂实验部分,bmscs经油红染色,细胞内无脂滴形成,染色结果为为阴性;成骨诱导实验部分,所得细胞传代至第三代,培养过程应用成骨细胞诱导剂,至21天茜素红染色显微镜下观察:细胞呈多层生长,排列次序重叠,单个细胞的梭形形态消失,多呈多角形形态,细胞间质内大量钙质沉积,茜素红染色呈钙化结节,染色结果为阳性;流式细胞仪检测bmscscd29的阳性率为93.7%,cd44为93.4%,cd45阳性率为0.32%。2×105细胞/孔接种细胞,膜片表面未形成沉积物,可清晰观察到细胞形态,细胞边缘折光性强,形成的细胞膜片活力旺盛;1.2透射电镜（tem）观察见胞膜完整,可见细胞突触及分泌泡,胞质丰富有大量胶原束,说明细胞状态良好。il-2、mmp-9和vegf在2×105接种密度的表达量低于其他细胞接种密度;il-10、tsp-1和tsg-6在2×105接种密度的表达量高于其他细胞接种密度。第二部分Fcm促使细胞的迁移明显,促使细胞的迁移,mscmedium和serum-freefcm与fcm相比抑制角膜基质细胞迁移,mscmedium与fcm相比显着影响基质细胞的增殖。elisa检测结果mscmedium中细胞因子il-10,tsp-1和tsg-6表达量明显高于fcm和serum-freefcm中细胞因子的表达量。第三部分3.1裂隙灯观察:实验组术后第7天可见角膜平滑,已完成上皮化;术后第14天可见角膜透明度良好,无瘢痕组织形成;术后第21天实验组bmsc观察结果,可见角膜已完全透明,眼表光滑,上皮完整,治疗效果明显。3.2组织病理学观察结果:实验组术后第7天可见细胞膜片比较疏松,角膜已完成上皮化;第14天细胞膜片已基本与角膜基质整合;第21天术后细胞膜片已完全与角膜基质整合。3.3 Westernblot实验结果:VEGF,MMP-9,IL-2和S100A8因子在第7天,第14天和第21天时正常组和BMSC处理组表达量很低,但是对照组中表达量明显增强,且随着时间表达增强;3.4 RT-PCR检测细胞因子表达结果:在正常的兔角膜基质各基因的表达量很低;在对照组（板层去除角膜创伤）中VEGF、MMP-9、S100A8和IL-2均明显升高;BMSC组与对照组相比,TSP-1、TSG-6和IL-10的表达变化有显着增多。3.5免疫荧光检测细胞因子表达:随着时间的延长,对照组角膜中侵润的CD4逐渐增多明显高于MSC处理组和正常组;对照组角膜中IL-2、MMP-9表达量均逐渐增多,明显高于MSC处理组和正常组;3.6 ELISA检测细胞因子结果:EGF,MMP-9,S100A8和IL-2在对照组高表达,且3周时表达量最高;TSP-1、TSG-6和IL-10在BMSCs膜片处理的实验组表达量较高,有效地抑制血管化,炎症和瘢痕组织。结论:体外构建BMSCs细胞膜片对角膜化学烧伤治疗作用明显,促进角膜上皮化,维持角膜基质透明,有效地抑制血管化,炎症和瘢痕组织。作用机制可能与上调TSP-1、TSG-6和IL-10表达,下调VEGF、MMP-9、S100A8和IL-2表达有关。
何静[8]（2006）在《细胞凋亡在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究》文中研究说明第一部分大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的实验研究目的研究大鼠角膜移植术后早期角膜植片基质细胞凋亡的发生规律。方法建立SD大鼠（受体）和Wistar大鼠（供体）同种异体穿透性角膜移植模型,SD大鼠自体穿透性角膜移植模型,并以对侧眼为正常对照。术后24h和7d,实验各组随机处死5只动物,取术眼角膜标本,TUNEL法检测角膜植片周边区和中央区基质层细胞凋亡情况;透射电镜观察凋亡细胞超微结构改变。结果1.实验各组角膜移植术后基质层凋亡细胞明显增多,主要存在于基质浅层,分布以植片周边区为主。2.术后24h,实验各组周边区与中央区的TUNEL阳性细胞计数较正常对照组升高（P<0.01）,且周边区高于中央区（P<0.01）。3.术后7d,实验各组周边区与中央区的TUNEL阳性细胞计数较术后24h下降（P<0.01）,且周边区仍高于中央区（P<0.01）。4.术后24h及术后7d,同种异体移植组和自体移植组相比,中央区TUNEL阳性细胞计数差异无显着性（P>0.05）,周边区TUNEL
张永强[9]（2006）在《腺病毒介导FasL基因转染大鼠角膜组织的实验研究》文中指出研究背景： 基因治疗是指把外界的正常基因或治疗基因，通过载体转移到靶细胞，进行基因修饰和表达，改善疾病的一种治疗手段，是治疗疾病的一种很有应用前景的新途径。基因治疗成功的关键在于建立有效的基因转移方法，使目的基因靶向性地表达于所需要治疗的组织。并且安全性好，不会引起毒性反应。 由于角膜组织具有位置表浅、组织透明性、易于观察等特点，所以该组织在基因治疗方面具有独特优势。近年来，各种病毒及非病毒载体应用于角膜基因转染方面的研究取得了一定进展，其中复制缺陷型腺病毒载体是一种相对高效的载体。不断改进基因治疗载体将有助于进一步提高基因转染的有效性和安全性。本实验主要对腺病毒载体转染大鼠角膜组织的效率进行了更深入地探讨。 基因治疗技术在角膜病方面的研究倍受人们关注，许多学者对此进行了探索性研究。通过基因治疗降低角膜移植术后免疫排斥反应、抑制准分子激光术后角膜瘢痕形成、治疗单纯疱疹性角膜炎等成为众多学者关注的焦点。 角膜移植免疫排斥反应仍是角膜移植手术失败的主要原因。近年来动物实验研究表明，在移植术前将免疫调节因子转染至供体角膜，有利于降低角膜移植术后排斥反应的发生。对该方面的不断深入研究必将为临床角膜移植排斥反应的防治提供良好的手段。
马慧香[10]（2005）在《TGF-β1基因修饰后板层人工生物角膜的免疫学研究》文中提出角膜病是主要的致盲性眼病之一,我国约有350万角膜病患者,居世界首位,同种异体角膜移植是角膜盲复明的主要手段。在无血管床进行角膜移植具有较高的成功率,排斥反应发生率仅为5～10%,但在高危患者（如:角膜化学伤和Stevens-Johnson综合征所致的角膜严重血管化,其他器官移植术后再行角膜移植,偏中心移植,大植片移植和二次移植等）其发生率可高达50%以上,此外供体材料来源匮乏也严重制约了该手术的开展和普及。因此,降低移植术后的排斥反应和寻找新的角膜供体材料成为眼科界研究的两大热点问题。 应用免疫抑制剂是目前预防和治疗角膜移植术后免疫排斥反应的主要手段,常用药物有皮质类固醇、环孢霉素A（Cyclosporin A,CsA）、FK506等,这些药物的联合使用能够有效地抑制排斥反应,但长期使用对机体有很大的毒副作用。故而,开发探索新型强效免疫抑制剂是提高异体或异种角膜移植手术成功率的有效途径。转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）作为一种比CsA活性更高的免疫抑制剂（Ruegemer等报道）,越来越引起人们的关注。TGFβ1是多肽类细胞因子,广泛参与免疫系统各细胞、因子间的相互调节,可抑制胸腺细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞等的增殖分化,干扰多种免疫球蛋白的产生和转换,并通过直接、间接影响IL-1、IL-2、IFN-γ及其受体而起以“负调节”为主的免疫平衡作用。近来,TG-β1,作为一种强效免疫抑制因子己被用于器官移植对抗免疫排斥反应、诱导移植物局部的免疫耐受,在小鼠和大鼠同种异体心脏移植及胰岛细胞移植模型中应用TGF-β1均能明显延长移植物存活时间,取
二、大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的初步研究（论文提纲范文）
（1）102例犬细菌性角膜溃疡的流行病学调查及手术对深层角膜溃疡的疗效观察（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 角膜溃疡的病因和愈合机制 |
| 1 角膜溃疡的病因与致病机制 |
| 1.1 角膜溃疡的病因 |
| 1.2 角膜溃疡的致病机制 |
| 2 角膜上皮层伤口的愈合机制 |
| 2.1 生长因子/细胞因子在上皮创面愈合中的作用 |
| 2.2 Toll样受体2 |
| 2.3 蛋白酶在上皮创面愈合中的作用 |
| 2.4 细胞外基质(ECM)在上皮创面愈合中的作用 |
| 3 角膜基质伤口的愈合机制 |
| 3.1 愈合过程中角膜细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞转化 |
| 3.2 免疫系统细胞在基质修复中的作用 |
| 3.3 创面愈合过程中基质细胞外基质的改建 |
| 3.4 与基质创面愈合过程相关的信号通路 |
| 第二章 治疗角膜溃疡方法的研究进展 |
| 1 药物治疗 |
| 2 角膜工程生物材料 |
| 2.1 胶原蛋白 |
| 2.2 丝素蛋白 |
| 2.3 明胶 |
| 2.4 脱细胞角膜 |
| 2.5 壳聚糖 |
| 2.6 其他合成聚合物水凝胶 |
| 3 手术治疗 |
| 3.1 角膜溃疡清创术 |
| 3.2 结膜瓣遮盖术 |
| 3.3 羊膜移植术 |
| 3.4 穿透角膜移植术 |
| 3.5 板层角膜移植术 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 102例犬角膜溃疡的流行病学调查及细菌分离鉴定与药敏试验 |
| 1 材料 |
| 1.1 临床病例 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 常用试剂配制 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 细菌的分离和纯化培养 |
| 2.3 MALDI Biotyper系统鉴定细菌和细菌保存 |
| 2.4 药物敏感性试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病因 |
| 3.2 发病率 |
| 3.3 品种 |
| 3.4 性别和年龄 |
| 3.5 治疗方法 |
| 3.6 治疗效果 |
| 3.7 细菌学分类 |
| 3.8 药物敏感性试验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 不同治疗方法对犬伪中间葡萄球菌性角膜溃疡的疗效观察 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要药品和试剂 |
| 1.3 试剂配制 |
| 1.4 仪器和设备 |
| 1.5 手术器械 |
| 2 方法 |
| 2.1 造模前准备 |
| 2.2 麻醉与保定 |
| 2.3 术部消毒 |
| 2.4 角膜溃疡模型建立 |
| 2.5 手术治疗前准备 |
| 2.6 抗生素治疗组 |
| 2.7 抗生素联合手术治疗组 |
| 2.8 术后护理 |
| 3 术后临床常规检查及裂隙灯观察 |
| 3.1 临床检查 |
| 3.2 裂隙灯检查 |
| 3.3 治疗过程中犬泪液量检测 |
| 3.4 犬眼内压测定 |
| 4 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 抗生素治疗组裂隙灯观察的变化 |
| 5.2 手术治疗组裂隙灯观察 |
| 5.3 临床评分 |
| 5.4 泪液量检测结果 |
| 5.5 眼内压检测结果 |
| 5.6 三种治疗方案的疗效 |
| 5.7 三种治疗方案的愈合时间 |
| 6 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 不同治疗方法对角膜溃疡模型犬角膜组织病理学与相关细胞因子表达的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 实验动物分组 |
| 2.2 实验犬术前准备 |
| 2.3 手术采样 |
| 2.4 组织切片制作 |
| 2.5 荧光定量PCR检测相关基因表达量 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 组织病理学观察 |
| 3.1.1 抗生素治疗组组织病理学观察 |
| 3.1.2 抗生素联合手术治疗组病理学切片观察 |
| 3.2 qPCR检测角膜细胞因子的结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 带蒂板层角膜移植术对犬深层角膜溃疡临床病例的疗效观察 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 临床病例介绍 |
| 2 方法 |
| 2.1 术前临床检查 |
| 2.2 手术方法 |
| 2.3 术后护理 |
| 2.4 术后临床检查 |
| 3 结果 |
| 3.1 术前检查结果 |
| 3.2 术后检查结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 附录 |
（2）小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物眼球及角膜结构 |
| 1.1.1 眼球的结构 |
| 1.1.2 角膜的结构 |
| 1.2 角膜碱烧伤引起的主要不良病变 |
| 1.3 小鼠角膜碱烧伤引起的血管新生和纤维化病变研究 |
| 1.3.1 哺乳动物角膜碱烧伤引起的血管新生 |
| 1.3.2 哺乳动物角膜碱烧伤引起的角质细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化 |
| 1.4 角膜碱烧伤的甲基化调控研究 |
| 1.4.1 表观调控及甲基化调控简介 |
| 1.4.2 角膜疾病中的甲基化调控研究及研究意义 |
| 1.5 角膜碱烧伤引起的炎症反应和免疫应答 |
| 1.6 Rapamycin(Rapa)对角膜碱烧伤治疗的研究 |
| 1.6.1 Rapa及mTOR简介 |
| 1.6.2 Rapa在碱烧伤治疗中的应用和研究意义 |
| 1.7 PI3K/AKT/mTOR、MAPK信号通路和HIF-1 对角膜碱烧伤影响的研究 |
| 1.7.1 PI3K/AKT/m TOR信号通路对血管生成的调控 |
| 1.7.2 HIF-1/VEGF通路对血管生成的调控 |
| 1.7.3 MAPK信号通路对血管生成的调控 |
| 1.8 选题依据、意义及研究内容 |
| 1.9 本研究的创新 |
| 第二章mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控、转录因子调控及信号通路PI3K/AKT和 MAPK/ERK调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要药物和试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物及模型建立 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 碱烧伤引起的角膜新生血管形态学数据采集 |
| 2.3.2 石蜡切片和Hematoxylin and Eosin(H&E)染色 |
| 2.3.3 冰冻切片及CD31、HIF-1α和VEGF免疫荧光染色 |
| 2.3.4 石蜡切片和Brd U免疫荧光染色 |
| 2.3.5 RNA提取及实时定量聚合酶链式反应(Quantitativereal-time polymerase chain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.6 DNA亚硫酸氢钠测序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP) |
| 2.3.7 电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA) |
| 2.3.8 蛋白提取及Western blot |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 时间梯度的筛选和建立 |
| 2.4.2 碱烧伤引起的角膜血管新生和Rapa处理对其形态的影响 |
| 2.4.3 碱烧伤及Rapa处理对角膜上皮层和基质层结构的影响 |
| 2.4.4 碱烧伤及Rapa处理对角膜细胞增殖的影响(Brd U+细胞染色) |
| 2.4.5 碱烧伤及Rapa处理对角膜血管生成的影响(CD31 染色) |
| 2.4.6 碱烧伤及Rapa处理对角膜VEGF和 α-SMA表达的影响 |
| 2.4.7mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控(DNA水平调控) |
| 2.4.8 转录因子ETV对去甲基化位点的负调控(转录水平调控) |
| 2.4.9 Rapa通过抑制碱烧伤诱导的PI3K/AKT/mTOR、HIF-1和MAPK信号通路活化,降低了VEGF的表达(蛋白水平调控) |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 碱烧伤诱导VEGF和 α-SMA表达与Rapa对角膜血管生成和纤维化的抑制作用 |
| 2.5.2 碱烧伤引起的角膜组织损伤和Rapa对其的修复 |
| 2.5.3 角膜碱烧伤及Rapa对其修复的分子机制 |
| 2.6 本章主要结论 |
| 第三章 小鼠角膜碱烧伤及Rapa治疗过程中的免疫应答 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要药物和试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物及模型建立 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠血清的采集 |
| 3.3.2 石蜡切片和H&E染色 |
| 3.3.3 CD45、F4/80和MPO冰冻切片的免疫荧光染色 |
| 3.3.4 RNA提取及qRT-PCR |
| 3.3.5 血清中TGF-β和 Foxp3的ELISA测定 |
| 3.3.6 流式细胞术对脾脏淋巴细胞的测定 |
| 3.3.7 角膜中TNF-α、MMP-2、p-mTOR和VEGF蛋白的检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CD45+、F4/80+、MPO+细胞通过角膜缘浸润进入基质 |
| 3.4.2 Rapa抑制碱烧伤诱导的炎症因子高表达 |
| 3.4.3 脾脏T细胞对小鼠角膜碱烧伤及Rapa处理的响应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 碱烧伤引起的炎症细胞浸润和Rapa对其过程的抑制 |
| 3.5.2 Rapa在多重细胞因子调控的炎症和血管生成中发挥作用 |
| 3.5.3 MMP-2对碱烧伤引起的血管重构发挥炎症因子作用 |
| 3.5.4 Rapa通过诱导CD4+CD25highTreg细胞生成调控角膜的损伤修复 |
| 3.6 本章主要结论 |
| Rapa在角膜碱烧伤诱导的损伤应答中的主要作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）血浆纤维蛋白膜负载骨髓间充质干细胞与角膜上皮细胞用于大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 角膜结构 |
| 2 角膜损伤 |
| 3 角膜损伤的治疗方式 |
| 4 干细胞 |
| 5 细胞支架 |
| 6 本课题设计思路与拟解决问题 |
| 第二章 大鼠BMSCs及角膜上皮细胞的分离培养与鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试药 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BMSCs的分离、培养与鉴定 |
| 2.2 角膜上皮细胞的分离、培养与鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs的形态学观察 |
| 3.2 BMSCs表面标记物的鉴定 |
| 3.3 角膜上皮细胞的形态学观察 |
| 3.4 角膜上皮细胞的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 角膜上皮细胞对接触共培养BMSCs的诱导分化 |
| 1 材料 |
| 1.1 主要试药 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BMSCs与角膜上皮细胞共培养 |
| 3 结果 |
| 3.1 BMSCs与角膜上皮细胞不同比例接触共培养7天后,BMSCs中角膜细胞相关基因△Ct值结果 |
| 3.2 BMSCs与角膜上皮细胞不同比例接触共培养7天后,BMSCs中角膜上皮细胞相关基因的相对表达量 |
| 4 讨论 |
| 第四章 血浆纤维蛋白膜的制备与性能检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试药 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 溶液配制 |
| 2.2 血浆纤维蛋白膜的制备 |
| 2.3 血浆纤维蛋白膜的超微结构表征 |
| 2.4 血浆纤维蛋白膜流变性检测 |
| 2.5 血浆纤维蛋白膜负载细胞 |
| 3 结果 |
| 3.1 血浆纤维蛋白膜的制备 |
| 3.2 血浆纤维蛋白膜形貌 |
| 3.3 血浆纤维蛋白膜流变学检测 |
| 3.4 血浆纤维蛋白膜负载细胞观察 |
| 4 讨论 |
| 第五章 负载BMSCs及角膜上皮细胞的血浆纤维蛋白膜片对大鼠角膜碱烧伤的治疗 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试药 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制备负载BMSCs和角膜上皮细胞的细胞膜片 |
| 2.2 负载BMSCs与角膜细胞的血浆纤维蛋白膜片治疗大鼠角膜碱烧伤 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 荧光素钠染色观察上皮缺损恢复情况 |
| 3.2 HE染色观察角膜结构恢复情况 |
| 3.3 免疫荧光染色检测角膜损伤的治疗情况 |
| 4 讨论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）卡替洛尔对大鼠角膜新生血管抑制作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 研究背景 |
| 1.1 β受体阻滞剂抑制新生血管的机理 |
| 1.1.1 β受体阻滞剂可抑制VEGF表达 |
| 1.1.2 β受体阻滞剂可抑制血管内皮细胞成管 |
| 1.1.3 β受体阻滞剂可减缓细胞增值,诱导细胞凋亡 |
| 1.2 β受体阻滞剂对眼部新生血管的抑制作用 |
| 1.2.1 β受体阻滞剂对视网膜新生血管的抑制作用 |
| 1.2.2 β受体阻滞剂对脉络膜新生血管的抑制作用 |
| 1.2.3 β受体阻滞剂对角膜新生血管的抑制作用 |
| 1.3 IVCM的临床应用 |
| 1.4 CNV治疗方法及大鼠碱烧伤CNV模型 |
| 1.4.1 CNV治疗方法 |
| 1.4.2 大鼠碱烧伤CNV模型 |
| 1.5 总结 |
| 1.6 本次研究的目的及意义 |
| 第二章 研究对象及方法 |
| 2.1 研究对象及纳入、排除标准 |
| 2.2 实验人员资质 |
| 2.3 信息记录及眼科检查 |
| 2.4 实验仪器及相关用物 |
| 2.4.1 实验仪器 |
| 2.4.2 相关用物 |
| 2.4.3 配制NaOH溶液(1mol/L) |
| 2.5 建立模型 |
| 2.5.1 建模前准备 |
| 2.5.2 建模方法 |
| 2.6 实验分组及干预措施 |
| 2.6.1 实验分组 |
| 2.6.2 干预措施 |
| 2.7 检查项目、方法及实验终点 |
| 2.7.1 大鼠眼前节照相 |
| 2.7.2 大鼠活体角膜共聚焦检查 |
| 2.7.3 实验终点 |
| 2.8 阅图及数据测量 |
| 2.8.1 实验结果评价指标 |
| 2.8.1.1 大鼠眼前节照相 |
| 2.8.1.2 大鼠角膜共聚焦显微镜 |
| 2.9 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 空白对照组检查结果 |
| 3.1.1 空白对照组眼前节照相结果 |
| 3.1.2 空白对照组IVCM检查结果 |
| 3.2 干预组检查结果 |
| 3.2.1 建模第1天检查结果 |
| 3.2.2 建模第4天检查结果 |
| 3.2.3 用药第4天检查结果 |
| 3.2.4 用药第6天检查结果 |
| 3.2.5 用药第12天检查结果 |
| 3.2.6 用药第14天检查结果 |
| 3.3 整体结果分析 |
| 3.3.1 前节照相结果 |
| 3.3.2 角膜共聚焦显微镜检查结果 |
| 3.4 实验结果总结 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）贝伐单抗抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管及淋巴管（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 制备缝线诱导的SD大鼠角膜新生血管及淋巴管模型 |
| 1.2.2 术后观察及处理 |
| 1.2.3 结果判断标准 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 角膜新生血管的裂隙灯显微镜观察及新生血管面积计算 |
| 2.2 显微镜下角膜组织切片HE染色 |
| 2.3 免疫组织化学方法检测VEGF-C蛋白表达的结果 |
| 2.4 免疫组织化学方法检测CD31蛋白表达的结果 |
| 2.5 透射电镜观察角膜新生血管及新生淋巴管 |
| 3 讨论 |
（6）基质透镜植入治疗圆锥角膜及角膜基质替代物的可行性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 1 引言 |
| 2 第一部分 飞秒激光辅助透镜植入后角膜交联术与交联术 |
| 2.1 材料及方法 |
| 2.2 结果 |
| 3 第二部分 异种角膜基质及3D打印角膜透镜作为角膜基质替代物的可行性研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在所学期间的科研成果 |
（7）兔骨髓间充质干细胞膜片对角膜化学烧伤的治疗作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 兔骨髓间充质干细胞的体外培养与细胞膜片的构建与鉴定 |
| 摘要 |
| 实验一 BMSCs的体外培养和鉴定 |
| 附图一 |
| 实验二细胞膜片的制备与鉴定 |
| 附图二 |
| 参考文献 |
| 第二部分 兔BMSC培养液上清液对角膜基质细胞影响的体外实验 |
| 摘要 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图三 |
| 参考文献 |
| 第三部分BMSC sheet对化学烧伤角膜的治疗作用与机制研究 |
| 摘要 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图四 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 致谢 |
（8）细胞凋亡在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文：细胞凋亡在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究 |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 FAS/FASL及其介导的细胞凋亡在大鼠角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 白细胞介素-1Β对角膜移植免疫排斥反应中细胞凋亡发生的影响的实验研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 大鼠角膜移植术后凋亡相关基因CASPASE-3MRNA 表达的初步研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 文献综述 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
（9）腺病毒介导FasL基因转染大鼠角膜组织的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 重组腺病毒Ad-EGFP转染大鼠眼前段组织的实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 7 附图 |
| 第二部分 角膜基质层间注射Ad-FasL转染大鼠角膜组织的实验研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 7 附图 |
| 第三部分 重组腺病毒Ad-FasL对大鼠高危角膜移植免疫的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 参考文献 |
| 7 附图 |
| 全文结论 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
| 文献综述 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 致谢 |
| 统计学合格证明 |
| 原创性声明及版权使用授权说明 |
（10）TGF-β1基因修饰后板层人工生物角膜的免疫学研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 真核表达载体pSecTag2-TGFβ_1MP的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TGF-β_1对培养角膜细胞生物学活性的影响 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第三部分 TGF-β_1成熟肽基因的转染及表达 |
| 一、TGF-β_1MP基因转染角膜内皮和角膜基质细胞 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 二、TGF-β_1MP基因在角膜细胞中的表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 三、转染细胞培养上清中TGF-β_1的免疫学活性检测 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 体外构建转基因后板层人工生物角膜移植的研究 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 全文总结 |
| 问题与展望 |
| 附录1 英文缩写词表 |
| 附录2 在读期间发表的论文、编着及参加的科研项目 |
| 致谢 |
四、大鼠角膜移植术后早期角膜基质细胞凋亡的初步研究（论文参考文献）
- [1]102例犬细菌性角膜溃疡的流行病学调查及手术对深层角膜溃疡的疗效观察[D]. 张红超. 扬州大学, 2021
- [2]小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究[D]. 李建德. 兰州大学, 2021(09)
- [3]血浆纤维蛋白膜负载骨髓间充质干细胞与角膜上皮细胞用于大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究[D]. 杨雪. 山东大学, 2020(04)
- [4]卡替洛尔对大鼠角膜新生血管抑制作用的实验研究[D]. 马进海. 兰州大学, 2020(01)
- [5]贝伐单抗抑制缝线诱导大鼠角膜新生血管及淋巴管[J]. 王剑超,穆廷魁,胡笳,刘子瑶,姚亮,秦莉. 山西医科大学学报, 2020(01)
- [6]基质透镜植入治疗圆锥角膜及角膜基质替代物的可行性研究[D]. 王玮玮. 浙江大学, 2019(03)
- [7]兔骨髓间充质干细胞膜片对角膜化学烧伤的治疗作用与机制研究[D]. 袁晔. 第二军医大学, 2015(07)
- [8]细胞凋亡在角膜移植免疫排斥反应中作用的实验研究[D]. 何静. 重庆医科大学, 2006(01)
- [9]腺病毒介导FasL基因转染大鼠角膜组织的实验研究[D]. 张永强. 第一军医大学, 2006(01)
- [10]TGF-β1基因修饰后板层人工生物角膜的免疫学研究[D]. 马慧香. 暨南大学, 2005(08)