论文摘要
目的:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis RA）的主要病变在关节,在关节内可以看到滑膜组织异常增生、大量炎性细胞浸润以及软骨与骨进行性破坏,在关节外则表现为血管炎。整个疾病过程中综合体现了滑膜组织增生、炎症、自身免疫这三种病理生理过程,它们之间相互作用、相互关联,贯穿于发病机制之中,形成了一个错综复杂的网络。成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes,FLSs）是从RA滑膜中分离得到的外观类似成纤维细胞的一类滑膜细胞。目前认为,由活化增生的FLSs过度分泌基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是造成RA关节软骨和骨被侵蚀和破坏的主要原因。IL-1β在诱导FLSs产生MMPs方面作用显著,被认为是引起RA骨和软骨基质降解的主要细胞因子之一。越来越多证据表明MMPs在RA骨和软骨进行性破坏过程中起重要作用。其中明胶酶A（MMP-2）是一种以降解I、IV、V、X、XI型胶原和明胶为主的基质金属蛋白水解酶,而这些成分都是关节软骨的重要组成部分。调控MMPs表达及合成的信号转导机制极其复杂,它们往往同时参与RA其它炎性介质的合成及细胞增殖等过程。研究表明,环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）通过前列腺素E（2prostaglandin E2,PGE2）具有促进MMPs分泌的作用。COX-2是RA进程中重要的诱导酶,同时也是PGE2合成过程中的限速酶。PGE2是一类重要的炎症介质。在RA中COX-2是通过PGE2发挥致炎作用的。在RA患者的滑膜细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、炎性单核细胞中可发现COX-2表达上升及PGE2大量生成,选择性COX-2抑制剂能通过抑制COX-2减少PGE2合成,从而缓解RA病人的炎症和疼痛症状。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases,MAPKs）通路活化是RA滑膜炎的重要特征之一。MAPKs主要包括细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulatedprotein kinase,ERK）、c-Jun氨基未端激酶（c-Jun amino-terminal kinase,JNK）和p38 MAPK三个亚家族。IL-1β是ERK、JNK和p38活化的主要诱导因子之一。MAPKs通路过度激活后,引起滑膜细胞产生和释放大量炎症因子,促进MMPs和PGs表达及参与细胞增殖过程。已有研究表明,抑制p38 MAPK活性可以减少体外培养RA FLSs MMP-1和-3分泌。但在RA FLS中COX-2表达与MMP-2分泌有何关系,是否通过PGE2依赖途径实现,ERK、JNK、p38 MAPKs对FLSs MMP-2的表达有何影响,有待于进一步研究证实。八肽胆囊收缩素（cholecystokinin octapeptide,CCK-8）是一种内源性脑肠肽,近年研究表明CCK-8具有抗炎和免疫调节作用。已有报道CCK-8对角叉菜胶诱导的大鼠关节炎有缓解作用。本室系列研究表明,CCK-8对TNF-α诱导RSC-364 MMP-1、-3、-2、-9分泌皆有抑制作用,其上游机制可能与CCK-8通过激活cAMP-PKA降低AP-1活性和p38 MAPK磷酸化水平有关;CCK-8对IL-1β诱导RSC-364 p38 MAPK磷酸化水平呈负性调节作用。但CCK-8对IL-1β诱导的RSC-364MMP-2表达的影响及其分子机制未见相关报道。本研究主要以滑膜细胞株RSC-364为对象,观察CCK-8对重组大鼠IL-1β（recombinant rat IL-1β,rIL-1β）诱导RSC-364 MMP-2表达的影响,是否通过依赖COX-2的PGE2途径发挥作用,并研究其上游信号转导机制,以进一步探讨CCK-8对滑膜细胞分泌的调节作用。方法:1 Western blot方法检测CCK-8、MAPKs对rIL-1β诱导RSC-364 COX-2及MMP-2表达的影响及CCK-8对MAPKs的影响。（1）检测rIL-1β对COX-2和MMP-2表达的影响:本部分实验主要观察rIL-1β与COX-2和MMP-2表达的时效关系,实验共分为5组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）1 h组;③rIL-1β（30μg/L）7 h组;④rIL-1β（30μg/L）12 h组;⑤rIL-1β（30μg/L）24 h组。（2）检测在rIL-1β作用下COX-2和PGE2对RSC-364 MMP-2表达的影响:为进一步探究rIL-1β是否通过COX-2和PGE2途径对RSC-364 MMP-2表达产生影响,选取MMP-2表达的高峰时间点,给予COX-2特异性抑制剂NS-398和COX-2反应产物PGE2,观察MMP-2表达有何变化。实验共分为8组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）组;③⑤rIL-1β（30μg/L）+ NS-398（2、5、10μmol/L）组;⑥单独NS-398（10μmol/L）组;⑦⑧PGE2（5、10μmol/L）组（。3）检测CCK-8对rIL-1β诱导RSC-364 COX-2及MMP-2表达的影响:选取rIL-1β诱导RSC-364 COX-2及MMP-2表达的高峰时间点观察CCK-8对COX-2及MMP-2的影响。本部分实验共分为6组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）组;③CCK-8（10-6 mol/L）组;④⑥rIL-1β+CCK-8(10-10、10-8、10-6 mol/L)组。（4）检测MAPKs对rIL-1β诱导RSC-364COX-2及MMP-2表达的影响:本部分实验主要观察rIL-1β诱导RSC-364 COX-2及MMP-2表达的上游信号转导机制。实验共分为6组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）组;③～⑤rIL-1β+SB203580（1、5、10μmol/L）/PD98059（1、5、10μmol/L）/SP600125（1、5、20μmol/L）组;⑥SB203580（10μmol/L）/PD98059（10μmol/L）/SP600125（20μmol/L）组。（5）检测rIL-1β对MAPKs活性的影响:本部分实验主要观察rIL-1β诱导MAPKs活化的高峰时间点。实验共分为6组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）5 min组;③rIL-1β（30μg/L）15 min组;④rIL-1β（30μg/L）30 min组;⑤rIL-1β（30μg/L）60 min组;⑥rIL-1β（30μg/L）120 min组。（6）检测CCK-8对rIL-1β诱导RSC-364 MAPKs的影响:本部分实验选取rIL-1β诱导MAPKs活化的高峰时间点,观察在rIL-1β作用下CCK-8对MAPKs磷酸化的影响。实验分为以下6组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）组;③CCK-8(10-6mol/L)组;④⑥CCK-8(10-10、10-8、10-6 mol/L)+ rIL-1β组。提取不同时间点的细胞总蛋白,用Western blot方法检测磷酸化MAPKs表达水平。Hema凝胶分析软件对其进行半定量分析,实验数据用SPSS统计软件进行分析,以P<0.05为有显著性差异。2酶免疫分析法（EIA）检测CCK-8和MAPKs对rIL-1β诱导RSC-364 PGE2分泌的影响。取对数生长期的RSC-364,用含10%胎牛血清的DMEM调整细胞浓度为1×105/ml,接种于24孔细胞培养板（1.0 ml/well）。实验共分为6组:①对照（control）组;②rIL-1β（30μg/L）组;③～⑤rIL-1β+CCK-8(10-10、10-8、10-6mol/L)组;⑥CCK-8(10-6 mol/L)组。为进一步探究rIL-1β诱导RSC-364 PGE2分泌的信号转导机制,又设SB203580（10μmol/L）/ PD98059（10μmol/L）/SP600125（20μmol/L）预孵育30 min后加rIL-1β组和单独SB203580（10μmol/L）/ PD98059（10μmol/L）/ SP600125（20μmol/L）组。各组细胞孵育24 h后,收集细胞培养上清,应用EIA检测PGE2含量。结果:1 CCK-8、MAPKs对rIL-1β诱导RSC-364 COX-2及MMP-2表达的影响及CCK-8对MAPKs的影响:对照组RSC-364中COX-2基本不表达,MMP-2呈少量表达。单独CCK-8对静息状态下RSC-364 COX-2和MMP-2的表达无明显影响。与对照组相比,rIL-1β孵育细胞1 h COX-2未见表达,7 h表达水平开始升高（P<0.05）,24 h最为明显（1.70±0.03 vs 0.00±0.00,P<0.05）,呈时间依赖趋势;CCK-8(10-1010-6mol/L)预孵育后能够剂量依赖性的抑制rIL-1β诱导的COX-2表达,抑制率分别为13.41%、24.39%、43.90%;ERK特异性抑制剂PD98059发挥了和CCK-8类似的作用,能够剂量依赖性的抑制rIL-1β诱导的COX-2表达,抑制率分别为5.95%、19.05%和35.71%,而p38 MAPK特异性抑制剂SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125均无此作用。与对照组相比,rIL-1β孵育细胞1 h和7 h,MMP-2的表达均无明显变化,12 h表达水平开始升高（P<0.05）,24 h最为明显（1.26±0.09 vs 0. 55±0.07,P<0.05）,呈时间依赖趋势;COX-2特异性抑制剂NS398能够剂量依赖性的抑制rIL-1β诱导的MMP-2的表达,与rIL-1β组相比,NS398 2、5、10μmol/L组MMP-2表达水平分别降低了15.38%、35.90%、43.59%;PGE2能够剂量依赖性的诱导MMP-2表达增加,PGE25、10μmol/L组MMP-2表达水平分别为0.39±0.03、0.64±0.06（与对照组相比P<0.05）。CCK-8(10-1010-6mol/L)预孵育后可剂量依赖性的抑制MMP-2的表达,抑制率分别为13.10%、29.76%、52.38%;ERK特异性抑制剂PD98059发挥了和CCK-8类似的作用,能够剂量依赖性的抑制rIL-1β诱导RSC-364 MMP-2的表达,抑制率分别为20.00%、23.08%和27.69%,而p38 MAPK特异性抑制剂SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125均无此作用。非磷酸化MAPKs和磷酸化MAPKs蛋白在未刺激的滑膜细胞中均有一定程度的表达。非磷酸化p38 MAPK、ERK、JNK在各试验组中的表达无明显变化（P>0.05）。与对照组相比,rIL-1β孵育5 min,p38 MAPK、ERK、JNK磷酸化水平升高,分别于30 min、15 min、30 min达高峰,表达量分别为0.37±0.09、0. 34±0.07、0.38±0.09（P<0.05）,2 h恢复基础水平（P>0.05）。CCK-8(10-6mol/L)预孵育后,磷酸化p38 MAPK、ERK、JNK的活性分别降低47.83%、43.24%和45.71%,表明CCK-8可以抑制rIL-1β的上述效应。而CCK-8对静息状态下RSC-364 p38 MAPK、ERK、JNK磷酸化水平无显著影响。2 CCK-8对rIL-1β诱导RSC-364 PGE2分泌水平的影响:与对照组相比,rIL-1β可明显增加细胞培养上清中PGE2含量（1385.76±238.28 pg/ml vs 163.64±33.07 pg/ml,P<0.05）。CCK-8预处理后有剂量依赖性的抑制rIL-1β诱导RSC-364 PGE2分泌增加的趋势,在rIL-1β+CCK-8(10-10、10-8、10-6mol/L)组PGE2含量分别为（1005.29±95.50 pg/ml）、（722.20±74.55 pg/ml）、（617.90±103.80 pg/ml）（与对照组相比P<0.05）。ERK特异性抑制剂PD98059发挥了和CCK-8类似的作用,能够抑制rIL-1β对RSC-364分泌PGE2的诱导作用,而p38 MAPK特异性抑制剂SB203580和JNK特异性抑制剂SP600125均无此作用。结论:本课题从PGE2依赖COX-2途径和MAPKs通路研究了CCK-8对rIL-1β激活RSC-364分泌MMP-2的影响及其信号转导机制,结论如下:1 rIL-1β可诱导RSC-364 COX-2及PGE2表达增加,使MMP-2蛋白表达增强,在rIL-1β促MMP-2分泌中发挥重要作用;同时rIL-1β可引起p38 MAPK、ERK、JNK通路活化,其中ERK通路活化对MMP-2蛋白表达增加呈正调控作用,提示它可能是rIL-1β促RSC-364 MMP-2分泌的一种重要机制。2本研究证实了CCK-8对rIL-1β诱导RSC-364分泌MMP-2具有负性调节作用,该作用可能是通过抑制ERK通路活化,对依赖COX-2的PGE2途径产生抑制性调节作用,从而下调MMP-2蛋白的表达。
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