非洲爪蟾白细胞介素8及γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶的克隆、表达及生物学活性研究

论文摘要

第一部分非洲爪蟾白细胞介素8Interleukin-8（IL-8）的研究。本研究成功克隆了非洲爪蟾的白细胞介素8并进行了鉴定。其编码框由312个碱基组成,可以编码含有103个氨基酸的蛋白质。非洲爪蟾的IL-8含有Glu-Leu-Arg （ELR）及四个保守的半胱氨酸,属于趋化因子中CXC家族。荧光定量PCR结果显示非洲爪蟾的白细胞介素8在脾脏和肾脏中高表达。非洲爪蟾的单核细胞受LPS刺激后6小时IL-8的表达量达到最高水准。通过采用与SUMO融合表达的方法,由BL21菌中通过Ni亲和层析制备到大量可溶重组IL-8并经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫转印检测（Western blotting）鉴定。趋化实验结果显示无论是与SUMO融合的IL-8蛋白还是单独的IL-8蛋白只对淋巴细胞发挥作用,而对单核细胞没有作用。第二部分非洲爪蟾γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的研究。非洲爪蟾GILT的cDNA序列包含一个771bp的编码框,编码一个由256个氨基酸组成的28.76KDa的蛋白质。其N-端包含一个15个氨基酸组成的信号肽。SMART分析发现X1GILT包含一个C69GGC72的活性位点及14QHGKEECIGNLIETC129的特征序列。组织定量分析显示X1GILT的mRNA在脾脏中含量最高,而肺中表达量最低。在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达了带有His6标签的重组可溶性GILT （XlsGILT）,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫转印检测鉴定。XlsGILT具有还原完整免疫球蛋白G （IgG）内部二硫键的活性,这些为非洲爪蟾作为一种模式生物来研究GILT在MHCⅡ抗原呈递过程中的二硫键还原中起的重要作用提供了可能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 第1章 白细胞介素8（IL-8）的研究进展
• 1.1 IL-8的生理生化特征
• 1.2 IL-8的基因结构、表达和调控
• 1.3 IL-8的受体
• 1.4 IL-8的生物学活性
• 1.4.1 IL-8对中性粒细胞的作用
• 1.4.2 IL-8对淋巴细胞的作用
• 1.4.3 IL-8对碱性粒细胞的作用
• 1.4.4 IL-8在血管发生中作用
• 1.5 IL-8在肿瘤发生中的作用
• 1.5.1 IL-8在肿瘤浸润转移中的作用及机制
• 1.5.2 IL-8在肿瘤血管生成中的作用
• 1.5.3 IL-8与其它因子在肿瘤进展中的相互作用
• 1.6 展望和结论
• 第2章 Γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的研究进展
• 2.1 GILT的活性特征
• 2.2 GILT的表达分布
• 2.3 GILT与相关疾病
• 2.4 国内外研究概况、水平和发展趋势
• 第3章 研究物种介简
• 3.1 非洲爪蟾简介
• 3.1.1 非洲爪蟾的分类及形态特征
• 3.1.2 非洲爪蟾的生活习性及分布
• 3.1.3 非洲爪蟾的研究用途
• 3.2 非洲爪蟾的研究进展
• 3.2.1 在疾病动物模型中的研究及应用
• 3.2.2 在药物筛选方面的研究及应用
• 3.2.3 在发育生物学、基因功能研究、疾病治疗等领域的应用
• 3.3 非洲爪蟾IL-8和GILT的研究进展
• 第二部分 实验部分
• 第4章 非洲爪蟾白细胞介素8的克隆、表达及活性鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物、质粒和宿主菌
• 4.1.2 试剂和耗材
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 非洲爪蟾IL-8基因的克隆
• 4.2.2 生物信息学分析
• 4.2.3 荧光定量（Real-time）PCR检测IL-8的组织表达
• 4.2.4 融合表达载体pSUMO-XlsIL-8的构建
• 4.2.5 IL-8蛋白体外表达
• 4.2.6 表达产物的纯化及western blot鉴定
• 4.2.7 LPS刺激实验
• 4.2.8 趋化实验
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 XlIL-8氨基酸序列生物信息学分析
• 4.3.2 XlIL-8mRNA组织分布研究
• 4.3.3 LPS刺激后XlIL-8表达量变化
• 4.3.4 SUMO-XlsIL-8蛋白的表达与纯化
• 4.3.5 SUMO-XlsIL-8和XlsIL-8蛋白趋化活性检测
• 4.4 讨论
• 第5章 非洲爪蟾Γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的克隆,表达和活性分析
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验动物、质粒和宿主菌
• 5.1.2 试剂和耗材
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 非洲爪蟾GILT基因的克隆
• 5.2.1.1 脾细胞中总RNA的提取和逆转录
• 5.2.1.2 PCR 法扩增 GILT
• 5.2.2 生物信息学分析
• 5.2.3 荧光定量（Real-time）PCR检测GILT的组织表达
• 5.2.4 表达载体pET28a-XlsGILT的构建
• 5.2.5 XlsGILT蛋白体外表达
• 5.2.6 表达产物的纯化及western b丨ot鉴定
• 5.2.7 体外琉基还原酶活性检测
• 5.3 实验结果与分析
• 5.3.1 非洲爪蟾GILT基因的克隆与鉴定
• 5.3.2 氨基酸序列的同源比对及系统发生分析
• 5.3.3 XlGILTmRNA组织分布研究
• 5.3.4 XlsGILT蛋白的表达与纯化
• 5.3.5 XlsGILT蛋白的巯基还原酶活性
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 附录：硕士在读期间研究成果
• 致谢