人乳铁蛋白基因的克隆、位点特异性重组载体的构建及细胞表达

论文摘要

人乳铁蛋白（human lactoferrin, hLTF）是乳汁中主要的铁结合蛋白,在多种组织、细胞内都有分布,但是哺乳动物乳汁中含量最高。在调节机体免疫和机体内铁的平衡、促进细胞生长等方面具有重要作用。而利用转基因动物乳腺反应器生产重组人乳铁蛋白（hLTF）的研究对人类健康有很重要的现实意义,具有广阔的市场前景和重要的理论价值。链霉菌ΦC31噬菌体整合酶（ΦC31 integrase）属于丝氨酸位点特异性重组酶（serine recombinase family）家族。它能识别宿主基因组上的细菌附着位点（bacterial attachment site,attB）和噬菌体附着位点（phage attachment site,attP）,从而介导同源序列之间的位点特异性重组。因为φC31整合酶所催化的反应具有序列识别特异性、并且不需要其他辅助因子,所以重组具有特异性和高度的保守性。φC31整合酶具有高效性和安全性、且具有DNA容量方面的优势,并且可以使目的基因得以持续、高效的表达。近年来随着研究的深入,人们对中C31整合酶介导整合作用的机制和影响因素有了进一步的认识,为今后如何利用非病毒载体系统进行基因治疗及转基因动物模型的建立提供了一种新的选择。本研究从人静脉血中性粒细胞中克隆出人乳铁蛋白基因（hLTF）,在前人构建的含有整合酶识别位点attB和加强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,eGFP）的真核表达载体pDB2的基础上构建以CMV为启动子、含有内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site,IRES）中的T2A序列的eGFP和hLTF基因共表达载体pSC3/HLTF。并将构建好的载体pSC3/HLTF转染到体外培养的人胚肾细胞（human embryonic kidney cells,HEK cells）,即293细胞（HEK 293 cell）中进行特异性表达,通过抗性基因新霉素抗性基因（neomycin,Neo）和报告基因eGFP筛选、纯化阳性克隆细胞,并检测。以检验该载体是否能够完整表达,从而确定该载体构建的合理性和可行性,并进而验证φC31整合酶对载体中外源基因的表达的效率的提高作用。研究结果如下：1.利用PCR的方法克隆了克隆出人乳铁蛋白基因。PCR产物回收纯化后,克隆在pGEM-Teasy vector的T位点。克隆产物经测序,结果分析表明,本研究中克隆得到的长度为2136bp的人乳铁蛋白基因的序列,其中包含完整的编码序列,与GenBank中登录序号为NM 002343.2的人hLTF基因cDNA序列的同源性为99.9%,且多出的三个碱基不影响蛋白的结构和功能。完全可用于构建真核表达载体。2.根据序列分析结果,用XhoⅠ和HindⅢ两种内切酶切下测序正确的阳性pGEM-Teasy载体上的hLTF基因,回收两端为XhoⅠ和HindⅢ酶切位点的片段hLTF1。同时用Xhol和HindⅢ双酶切质粒载体pSC1,回收片段pSC1。然后将基因片段hLTF1与载体片段pSC1用T4 DNA连接酶连接,得到质粒载体pSC1/HLTF。用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切质粒载体pSC1/HLTF,回收两端为XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点的片段hLTF2。同时用XhoⅠ和HindⅢ双酶切含有T2A序列的质粒载体pSC2,回收片段pSC2。然后将基因片段hLTF2与载体片段pSC2用T4 DNA连接酶连接,得到质粒载体pSC2/HLTF。用BamHⅠ和HindⅠⅢ双酶切质粒载体pSC2/HLTF,回收两端为BamHⅠ和HindⅠⅢ酶切位点的片段hLTF3。同时用BamHⅠ和HindⅠⅢ双酶切含有attB位点、CMV启动子、eGFP的穿梭载体pDB2,回收片段pDB2。然后将基因片段hLTF3与载体片段pDB2用T4 DNA连接酶连接,得到穿梭载体pSC3/HLTF。并进行酶切鉴定,筛选阳性克隆。3.携带hLTF基因的穿梭载体pSC3/HLTF和含有ΦC31整合酶基因的瞬间表达载体通过磷酸钙转染的方法成功的共转染了293细胞。在体外经过G418筛选培养7天后,在荧光显微镜下能观察到绿色荧光,证明在该培养筛选系统中整合到细胞基因组的报告基因eGFP基因得到了表达。RT-PCR检测表明该培养筛选系统中整合到细胞基因组的hLTF基因得到了表达。并且通过在荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光证明：与ΦC31整合酶基因的瞬间表达载体共转染的细胞eGFP基因的表达显著提高。4.证明了以eGFP作为报告基因来构建乳腺特异性表达载体的可行性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 转基因动物乳腺生物反应器的研究进展
• 1.1.1 转基因动物建立方法
• 1.1.2 乳腺反应器研究进展
• 1.1.3 人乳铁蛋白基因
• 1.2 位点特异性重组载体
• 1.2.1 位点特异性重组酶
• 1.2.2 φC31重组酶作用机制
• 1.2.3 φC31整合酶转基因动物研制中的应用
• 1.2.4 φC31整合酶在基因治疗中的应用
• 1.2.5 φC31整合酶催化效率影响因素
• 1.2.6 φC31整合酶整合的安全性
• 1.3 本研究的目的、意义
• 第2章 人乳铁蛋白基因的克隆
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 粒细胞总RNA提取
• 2.2.2 人乳铁蛋白基因全长cDNA序列的扩增
• 2.2.3 重组质粒酶切鉴定
• 2.2.4 序列分析
• 2.3 讨论
• 第3章 携带人乳铁蛋白基因的位点特异性重组载体的构建
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 实验结果
• 3.3 讨论
• 第4章 位点特异性重组载体pSC3/hLT转染293细胞
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 抗性筛选
• 4.2.2 转染后细胞的GFP检测
• 4.2.3 阳性细胞的PCR鉴定结果
• 4.3 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间研究成果