Mitofilin蛋白下调诱导细胞凋亡的机制研究

论文摘要

Mitofilin是线粒体重要的内膜嵴形态维持蛋白，干涉Mitofilin的表达，细胞凋亡增加，但对其影响凋亡的具体机制稍不明确。本研究以此为切入点，进行了对其下调诱导细胞凋亡的机制研究。本论文首先对Mitofilin的功能进行了研究，构建了Mitofilin的慢病毒干涉载体，并且获得了干涉Mitofilin的稳定细胞株。在此基础上，通过间接免疫荧光技术，激光共聚焦显微镜观察线粒体网络结构，透射电子显微镜观察线粒体内膜结构变化，并且利用特异性染料标记细胞内分子，流式细胞术检测线粒体功能。结果发现，下调Mitofilin的表达，线粒体功能损伤。进一步检测了Mitofilin蛋白下调介导的细胞行为学效应。正常条件下，下调Mitofilin的表达，细胞凋亡比例增加。本实验利用依托泊苷(10μg/mL)诱导细胞凋亡，检测了过表达和干涉Mitofilin细胞凋亡变化。实验室前期通过酵母双杂交阵列筛选和GST沉降技术发现Mitofilin和Tim23存在蛋白质相互作用。本研究通过外源和内源免疫共沉淀证实Mitofilin与Tim23存在相互作用。进一步构建了Mitofilin和Tim23的截短体，并且通过GST沉降实验确定了两者相互作用的区段。本实验进一步检测了回转Tim23及其相应缺失体后，细胞凋亡的变化情况，并且利用蛋白质稳定性实验检测了Mitofilin对Tim23稳定性的影响。实验发现，过表达Mitofilin可以减少依托泊苷刺激下的细胞凋亡，并有效抑制Tim23的降解；相反，干涉Mitofilin可以加快细胞凋亡进程，加速Tim23的降解，但是体系中回转Tim23，凋亡比例有所下降，而回转Tim23的缺失体后，细胞凋亡无明显变化。综上所述，我们得出以下结论，Mitofilin对线粒体的功能至关重要，并且可以参与细胞凋亡过程，Mitofilin通过与Tim23的相互作用影响细胞凋亡进程，揭示了其对细胞凋亡影响的分子机制，并且为进一步研究这一对相互所用介导的生物学效应奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 Mitofilin 的结构与功能
• 1.1.1 Mitofilin 的结构
• 1.1.2 Mitofilin 的功能
• 1.2 线粒体蛋白的转运与 Tim23
• 1.2.1 线粒体蛋白的转运
• 1.2.2 TIM23 复合体的组成
• 1.2.3 Tim23 的结构与功能
• 1.3 线粒体与细胞凋亡
• 1.4 线粒体内膜结构与动态网络
• 1.5 蓝色温和电泳技术 BN-PAGE
• 1.6 慢病毒载体系统
• 1.7 本课题的研究背景及立题依据
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试剂
• 2.1.2 细胞株
• 2.1.3 菌株、载体
• 2.1.4 动物
• 2.2 常用试剂、溶液的配制
• 2.2.1 Western Blot 相关试剂
• 2.2.2 细胞裂解溶液及免疫沉淀相关溶液
• 2.2.3 BN-PAGE 和 hrCN-PAGE 相关溶液
• 2.2.4 呼吸链复合体酶活显色液和终止液
• 2.2.5 细胞培养相关溶液
• 2.2.6 细菌培养相关溶液
• 2.3 主要仪器设备
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 一般细胞培养条件
• 2.4.2 细胞总蛋白的提取
• 2.4.3 免疫印迹（Western-blot）
• 2.4.4 载体构建
• 2.4.5 转染
• 2.4.6 shRNA 载体构建
• 2.4.7 慢病毒包装、浓缩、感染及滴度测定
• 2.4.8 细胞 RNA 提取
• 2.4.9 RT-PCR
• 2.4.10 Real-time PCR
• 2.4.11 集落形成实验
• 2.4.12 细胞凋亡诱导实验
• 2.4.13 细胞凋亡检测（Annexin V-PE/7-AAD 双标法）
• 2.4.14 细胞周期检测
• 2.4.15 RNA 干扰实验
• 2.4.16 线粒体功能检测
• 2.4.17 线粒体网络观察
• 2.4.18 线粒体内膜结构观察
• 2.4.19 细胞 ATP 含量测定
• 2.4.20 慢病毒小鼠体内转染
• 2.4.21 线粒体蛋白质的提取
• 2.4.22 呼吸链复合体活性检测
• 2.4.23 Mitofilin 蛋白与 Tim23 蛋白相互作用的验证
• 2.4.24 蛋白质相互作用结构域的确定
• 2.4.25 蛋白稳定性实验
• 2.4.26 统计学分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 Mitofilin 蛋白下调对线粒体的影响
• 3.1.1 pSicoR-GFP-Mitofilin 干涉载体构建及干涉效果鉴定
• 3.1.2 Mitofilin 干涉稳定细胞株的构建
• 3.1.3 Mitofilin 下调导致线粒体内膜结构紊乱
• 3.1.4 Mitofilin 下调改变线粒体网络结构
• 3.1.5 Mitofilin 下调损伤线粒体功能
• 3.1.6 Mitofilin 下调降低线粒体呼吸链复合体 V 活性
• 3.1.7 Mitofilin 下调细胞 ATP 检测
• 3.1.8 小结
• 3.2 Mitofilin 蛋白对细胞凋亡的影响
• 3.2.1 Mitofilin 下调阻滞细胞周期进程
• 3.2.2 Mitofilin 下调降低细胞集落形成能力
• 3.2.3 Mitofilin 下调细胞凋亡比例增加
• 3.2.4 Mitofilin 蛋白的表达变化对细胞凋亡的影响
• 3.2.5 Mitofilin 与 Tim23 相互作用的确证
• 3.2.6 Mitofilin 对 Tim23 稳定性的影响
• 3.2.7 回转 Tim23 减少 Mitofilin 下调诱导的细胞凋亡
• 3.2.8 小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况
• 致谢
• 附录