论文摘要
【背景】糖尿病已经成为严重危害人类健康的慢性非传染性疾病。目前，糖尿病患病率在全球范围内呈逐年增高的趋势，给个人和社会带来巨大的经济负担。糖尿病中90％以上为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）。2型糖尿病的发病机制尚未完全阐明。目前认为胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的重要环节之一，这一点已为长期大量的研究所证实。Banerji等报告BMI小于30kg／m2的非洲裔美国男性NIDDM，60％有胰岛素抵抗。而Haffner等报告对包括非洲裔、西班牙裔及非西班牙裔白种人，胰岛素抵抗占本系列2型糖尿病的92％。因此，改善胰岛素抵抗对于预防和治疗2型糖尿病至关重要。近年来脂肪细胞缺陷在胰岛素抵抗的机理研中表现究尤为活跃。脂肪细胞的缺陷在大体上首先表现在脂肪分布部位的异常，特别是腹部内脏脂肪如网膜及其他脏器周围脂肪的堆积。其次表现为脂肪细胞肥大，脂肪细胞体积增大。脂肪细胞的缺陷还和脂肪细胞分泌的脂肪因子关系密切。脂肪细胞内分泌功能的发现是近年内分泌科学领域的突破性进展之一，打破了脂肪组织仅作为能量储存组织的传统观念。至今已经发现几十种脂肪细胞因子及蛋白质因子。如：脂联素（Adipsin）、瘦素（Adipsin）、抵抗素（Adipsin）、视黄醇结合蛋白（RBP），肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、PAI-1等。这些因子分泌的增多或减少与胰岛素抵抗关系密切。视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP）是维生素A的运载蛋白，早期研究里，RBP主要用于糖尿病肾病的早期检测。2004年Yang等利用基因芯片鉴定出一种新的参与胰岛素抵抗的脂肪因子，即视黄醇结合蛋白4（RBP4）。研究表明，在没有发生糖尿病，但是出现IGT或者IFG并且钳夹实验表明存在胰岛素抵抗的人群中，血浆RBP4的水平明显高于正常人群。RBP4的升高主要和胰岛素抵抗的程度相关。甚至研究还证实在血糖正常（无IGT、IFG）但直系亲属中存在2型糖尿病患者的人群的RBP4的水平较正常对照组高。这些结果都表明，RBP4与胰岛素抵抗、2型糖尿病的发生存在密切联系。罗格列酮（Rosiglitazone）作为一种新型的噻唑烷二酮类（Thiazolidinediones，TZDs）胰岛素增敏剂，在临床上已广泛应用于胰岛素抵抗和2型糖尿病的治疗。其主要作用机制是通过竞争性激活过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ），提高肌肉及脂肪组织对胰岛素的敏感性。研究证实，罗格列酮在降低血糖、改善脂代谢、改善高胰岛素血症和改善胰岛素抵抗方面有重要作用。罗格列酮在近期研究中被证实可以降低大鼠血浆RBP4水平，从而减轻胰岛素抵抗，提示其改善胰岛素抵抗的机制也可能是通过降低RBP4表达而实现的。为了更好的观察胰岛素状态下RBP4、GLUT4水平变化的情况以及罗格列酮药物干预对抵抗状态下RBP4表达的影响，我门进行了体内外实验。体内实验选用了国际标准的慢性自发性T2DM大鼠模型之一OLETF（Otsuka Long-EvansTokushinma Fatty），并建立T2DM模型；体外试验采用的是美国ATCC的前脂肪细胞株3T3-L1细胞，并进一步诱导成为成熟脂肪细胞，建立体外胰岛素抵抗模型。通过观察体内外脂肪细胞RBP4和GLUT4动态变化的情况，同时观察罗格列酮对RBP4、GLUT4的干预作用。应用RT-PCR方法检测脂肪细胞RPB4、GLUT4mRNA表达水平，从分子生物学水平探讨RBP4在胰岛素抵抗发生的过程中所扮演的角色，为临床改善胰岛素敏感性提供新的思维。具体研究分一下二部分：第一章视黄醇结合蛋白4（RBP4）在3T3-L1细胞表达的初步观察【目的】通过体外建立3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型，应用罗格列酮进行干预治疗，观察胰岛素抵抗状态下RBP4、GLUT4的表达情况，并观察罗格列酮对RBP4的作用，分析其对胰岛素抵抗的干预作用是否与降低RBP4的表达有关。【方法】1、以美国国立细胞库（American Type Culture Collection，ATCC）3T3-L1细胞作为实验对象进行培养和诱导分化。参考Anil Kumar K．L分化前脂肪细胞的方法，对细胞进行分化：将3T3-L1前脂肪细胞置于含10％小牛血清的DMEM高糖培养基中，37℃，5％CO2饱和湿度下培养。细胞状态良好时接种于培养皿，待细胞融合2 d后，加入含0.5 mmol／L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、10μg／mL胰岛素、1μmol／L地塞米松10％小牛血清的DMEM高糖培养基培养48 h，之后换以含10μg／mL胰岛素的培养基再培养48 h，随后以10％小牛血清的DMEM高糖培养基继续培养，2 d换培养液1次，诱导分化8～12 d的3T3-L1细胞，80％～90％以上呈脂肪细胞表型可用于试验。2、运用油红O染色证明前脂肪细胞诱导成为成熟脂肪细胞。移去诱导分化结束细胞的培养基，用PBS洗3次，用Ca-甲醛固定5-15 min，弃去固定液，PBS洗3次，然后将细胞晾干20min；加入油红O溶液，染色1 h，弃去染色剂，用异丙醇洗去未着色的染料，然后用苏木精复染细胞核，倒置显微下观察、照相。3、3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗细胞模型的建立及药物处理。对分化好的细胞分组进行处理，加1μmol／L地塞米松诱导胰岛素抵抗，每2d换1次液，取上清液，以培养基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抵抗的程度。葡萄糖含量用葡萄糖检测试剂盒测定。在胰岛素抵抗模型成立以后，设空白对照组、地塞米松模型组、药物干预组(罗格列酮，终含量为10-5 M)，在药物处理48 h后检测培养基中葡萄糖含量，及RBP4、GLUT4mRNA表达水平。【结果】1、模型组细胞上清培养液的吸光度OD值显著高于空白组（P＜0.01），药物干预组培养液的吸光度OD值较模型组低，（P=0.047）。2、地塞米松模型组的GLUT4mRNA水平显著低于空白组（P＜0.01），药物干预组GLUT4表达水平明显著高于模型组（P＜0.05）。地塞米松模型组的RBP4mRNA表达水平显著高于空白组（P＜0.01），药物组RBP4显著低于模型组（P＜0.05）。3、地塞米松模型组处理48 h GLUT4mRNA表达水平与RBP4mRNA表达水平不存在相关关系（P=0.758）。【结论】1、地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型中RBP4的表达升高，GLUT4表达下降；2、罗格列酮可以降低胰岛素抵抗状态下3T3-L1细胞RBP4的表达，同时上调GLUT4的表达；3、罗格列酮处理后胰岛素抵抗状态下的3T3-L1细胞葡萄糖摄取率上升。第二章罗格列酮对OLETF鼠RBP4的影响，以及RBP4在OLETF鼠内脏脂肪表达的初步观察【目的】比较自发性2型糖尿病OLETF鼠与同家系LETO鼠脂肪组织视黄醇结合蛋白（RBP4）水平；观察罗格列酮对RBP4的干预作用；观察脂肪组织RBP4与GLUT4水平的相关性，从而探讨RBP4导致胰岛素抵抗的可能机制。【方法】OLETF大鼠随机分成糖尿病对照组和罗格列酮干预组，以同家系不同种的LETO大鼠作为空白组。8周龄始，干预组以罗格列酮每日3mg／kg体重灌胃，直至40周龄。行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），鉴定糖尿病发病情况。应用逆转录-聚合酶链（RT-PCR）技术分析RBP4 mRNA在糖尿病大鼠各组织中的表达水平及罗格列酮对RBP4 mRNA表达的影响。【结果】1、对照组在未发生糖耐量异常以及无糖尿病发生时已经出现肥胖。6周龄始对照组和干预组体重高于LETO组（P＜0.05）。对照组内脏脂肪8周龄开始显著高于LETO组（P＜0.05）。2、对照组和干预组13周龄开始葡萄糖曲线下面积（AUC）显著高于LETO组，并随周龄增加进一步升高。对照组23周龄开始出现第1例糖尿病，并随着周龄发病率逐渐升高，40周龄时糖尿病发病率达到92.9％。3、8周龄OLETF大鼠脂肪组织GLUT4mRNA表达显著低于LETO组（P＜0.05），随周龄的增加逐渐降低，而RBP4mRNA表达则显著高于LETO组（P＜0.01），随周龄增加逐渐升高。4、干预组脂肪组织RBP4mRNA表达量显著低于对照组（P＜0.05），GLUT4mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05）。观察32、40周龄时对照组RBP4与GLUT4的mRNA表达水平不存在相关关系（P=0.585，P=0.667）。【结论】1、OLETF大鼠脂肪组织RBP4在未出现糖尿病异常、未出现糖尿病时出现高表达，推测RBP4可能与胰岛素抵抗密切相关。2、OLETF大鼠脂肪组织在RBP4表达升高的同时GLUT4表达下降，但两者未存在相关关系。3、罗格列酮可能通过降低RBP4水平，增加葡萄糖的摄取率，改善胰岛素敏感性，从而达到其预防2型糖尿病的目的。