论文题目: 茶氨酸和茶氨酸合成酶活性的毛细管电泳检测及酶学研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 茶学
作者: 李平
导师: 宛晓春
关键词: 茶氨酸,定量,茶氨酸合成酶,活性检测,分离纯化,生物合成途径
文献来源: 安徽农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 茶氨酸是一种非蛋白质氨基酸,它在茶树新梢鲜叶的含量占茶叶干物质的1.2%-2.0%。迄今为止,茶氨酸仅被发现存在于山茶科植物和一种蕈体内,是具有生物活性的次生代谢产物。茶氨酸除了在生物体内发挥重要的生理、生化功能外,对人和动物还具有很好的保健功能和药理作用,因此不仅可以作为食品和保健品中的添加剂,而且在医药行业有潜在的应用前景。 在茶氨酸的测定、提取、分离、制备、合成和实际应用等方面已经取得了一些成果。1993 年 Abelian V.通过酶发酵法成功地实现了茶氨酸的工业化大规模生产,但所用的酶对乙胺的亲和力较低而导致了产物中的乙胺残留。为了从根本上解决茶氨酸的生物合成问题,探讨与茶氨酸合成关系密切的酶--茶氨酸合成酶尤显重要。早在1963 年 Sasaoka K.等就发现了该酶,并从生物化学角度作了较为系统的研究。但在随后的 40 多年里茶氨酸合成酶的研究报道甚少,尤其茶氨酸合成酶分子生物学的信息几乎没有。为了探讨茶氨酸在茶树体内的生物合成的调控机理,指导茶树的分子育种,探索茶氨酸生物合成的新途径,构建生产茶氨酸的工程菌,更好地开发茶氨酸在食品和医药上的功效,本论文主要在茶氨酸及其合成关键酶的检测和初步纯化等方面开展了一系列工作。 研究了茶籽的培育条件,从不同组织中分离、提取茶氨酸合成酶,并初步探讨一些理化因素对茶氨酸合成酶表达的诱导作用。试验发现以沙子为载体,茶籽在 20℃条件下培育 2 周时生长最好。通过制备丙酮粉,利用丙酮和硫酸铵沉淀法,从不同组织部位中提取茶氨酸合成酶。证实了丙酮粉粗酶液中,茶苗根中的茶氨酸合成酶活性约为茶籽苗和茶树鲜叶的 7.1 倍,而其蛋白质含量仅为后两者的 1/4。运用水杨酸浸泡、避光培养处理茶籽,茶苗表现出最高的茶氨酸合成酶活性,为自然光条件下培育的茶籽苗中的酶活的 4.7 倍,说明避光和水杨酸对茶氨酸合成酶表达具有诱导作用。 建立了胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸的新方法,比国内目前报道的其它方法快速、准确、经济、自动化程度高。试验以 2,4-二硝基氟苯为衍生化试剂,在 50℃的 pH 9.5 硼酸缓冲液中作用 25min 后可以得到较稳定的在 360nm 处有最大吸收峰的衍生化产物。研究了影响毛细管电泳分离效果的主要因素,确立了毛细管电泳分离的最佳条件:以 0.03mol/L pH9.8 四硼酸钠为电泳缓冲液,内含 2.5%的 Brij35和 15%的异丙醇,压力进样时间为 5s,分离电压为 28kV,分离温度为 17℃,分离用
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第1章 前言
1.1 茶氨酸概述
1.1.1 茶氨酸
1.1.2 茶氨酸的生理作用
1.1.3 茶氨酸的生理活性和药理作用
1.1.4 茶氨酸的应用
1.1.5 茶氨酸的合成与制备
1.1.6 茶氨酸在动物及人体内的吸收、代谢
1.1.7 茶氨酸的安全性与稳定性
1.2 茶氨酸合成酶的研究概述
1.3 茶氨酸及其合成关键酶的研究意义
1.4 课题主要研究内容及来源
第2章 茶氨酸合成酶的分离提取
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 茶籽培养条件优化
2.3.2 培育的茶籽苗
2.3.3 制备的丙酮粉
2.3.4 茶氨酸合成酶提取条件探讨
2.3.5 不同组织部位中的茶氨酸合成酶
2.3.6 茶氨酸合成酶的诱导结果
2.4 小结
第3章 毛细管电泳技术定量茶氨酸
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 仪器
3.2.2 试剂
3.2.3 样品处理
3.2.4 衍生化方法
3.2.5 毛细管电泳的分离
3.3 结果与讨论
3.3.1 茶氨酸的衍生化
3.3.2 茶氨酸衍生化反应条件的研究
3.3.3 茶氨酸衍生化产物稳定性实验
3.3.4 毛细管电泳色谱条件的优化
3.3.5 茶氨酸定量方法的方法学研究
3.3.6 茶氨酸标样的毛细管电泳分离图谱
3.3.7 17 种标准氨基酸的毛细管电泳分离图谱
3.3.8 茶汁样品中游离氨基酸的毛细管电泳分离图谱
3.3.9 茶氨酸标准曲线的获得
3.3.10 不同茶样中茶氨酸含量测定结果
3.4 小结
第4章 茶氨酸合成酶活力检测方法及其酶学性质研究
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂
4.2.3 方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 不同衍生化反应体系毛细管电泳分离图谱
4.3.2 产物的回收率
4.3.3 样品的茶氨酸合成酶活性检测
4.3.4 茶氨酸合成酶反应条件优化
4.4 小结
第5章 茶氨酸合成酶的部分纯化
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 离子交换层析
5.3.2 凝胶过滤层析
5.3.3 茶氨酸合成酶的纯化结果分析
5.3.4 含茶氨酸合成酶的样品的 SDS-PAGE
5.3.5 亲和层析的尝试
5.4 小结
第6章 茶氨酸生物合成途径及相关启示
6.1 自然界生物体合成天然茶氨酸的代谢途径
6.1.1 茶树体内茶氨酸生物合成途径
6.1.2 褐绒盖牛肝菌体内茶氨酸生物合成的可能途径及相关启示
6.2 人工酶法合成茶氨酸的代谢途径
6.2.1 谷氨酰胺合成酶合成茶氨酸的途径
6.2.2 γ-谷氨酰基转肽酶合成茶氨酸的途径
6.2.3 γ-谷氨基甲酰胺合成酶合成茶氨酸的途径
6.3 茶氨酸相关研究的思考
主要结论
参考文献
作者简介
致谢
发布时间: 2005-07-28
参考文献
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