论文摘要
目的：通过研究白头翁总皂苷（Pulsatilla chinensis （Bunge） Regel saponins，PRS）对日本血吸虫（Schistosoma japonicum）中间宿主钉螺（Oncomelania hupensis）的杀灭作用、对钉螺新陈代谢关键酶的影响、对斑马鱼和哺乳动物的毒性、对日本血吸虫体内外不同发育阶段的作用及对感染日本血吸虫小鼠的免疫调节作用，为白头翁总皂苷成为新的抗血吸虫新药提供理论和实验依据。方法：1.采用浸泡法，进行浸杀钉螺试验、钉螺上爬试验及斑马鱼毒性试验；采用酶促动力学方法检测钉螺暴露在PRS浓度为浸泡24h LC50的40%和80%药液中24h后的头足及肝脏胆碱酯酶（choline esterase，CHE）、丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase，ALT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的酶活值；采用透射电镜观察浓度为24h LC50的PRS作用钉螺后其头足及肝脏的超微结构；采用中华人民共和国国家标准GB15670-1995进行哺乳动物急性经口毒性试验和皮肤、眼睛刺激试验。2.采用尾蚴腹部贴片法感染ICR小鼠，感染后42d的小鼠肝脏经过研磨、过筛获得虫卵，毛蚴由虫卵孵化，尾蚴由阳性感染钉螺光照逸出，用含有0、1、2、3、4、5、6、7、8μg/ml的PRS药液分别在不同的时间作用于虫卵、毛蚴、尾蚴；PRS对体外培养的日本血吸虫不同发育阶段的作用采用经皮肤或灌注冲虫法在3h、7、14、42d对感染不同数量尾蚴的小鼠进行剖杀取虫，用含有0、1、5、10、20、30μg/ml的PRS培养液对童虫及成虫进行培养，观察药物在不同时间段的杀虫作用；将感染50条日本血吸虫尾蚴的小鼠在血吸虫不同发育阶段用不同剂量的PRS药液灌服，42d后灌注冲虫计算荷虫量及减虫率；将感染80条尾蚴的小鼠在感染后的不同时间经过尾静脉注射25mg/kg PRS药液，42d后灌注冲虫计算荷虫量及减虫率；PRS对日本血吸虫糖原、蛋白及酶的影响采用对感染42d的小鼠一次性尾静脉注射25mg/kg的PRS药液，24h后剖杀取虫研磨，检测PRS对虫新陈代谢的影响。3.采用感染50条尾蚴的C57BL/6小鼠连续49d口服150mg/kg/d剂量的PRS，通过检测小鼠体重、肝脾重量的变化及减虫效果估计长期用药的治疗效果；通过检测感染治疗组与感染不治疗组之间小鼠白细胞及其组成细胞的比率变化、肝脏的免疫组化、血清IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17水平的变化、虫卵可溶性抗原（solubleegg antigen，SEA）特异性抗体IgG、IgG1、IgG2a值的改变探究PRS对日本血吸虫感染小鼠的免疫调节作用。结果：1. PRS经过24h、48h、72h浸杀钉螺后的LC50分别为0.48、0.23、0.17mg/l，LC90分别为2.64、0.81、0.34mg/l；8和4mg/l PRS作用后无钉螺上爬，0.5mg/l PRS作用24h后总上爬率为26.67%，0.5mg/l NIC作用24h后总上爬率为47.78%。钉螺用PRS浓度为40%及80%的24h LC50浸泡24h后，其头足及肝脏的CHE、AKP、ALT的活力明显降低（P＜0.05），LDH变化不大；24h LC50PRS作用24h后，钉螺头足及肝脏细胞的透射电镜显示PRS对钉螺的超微结构有一定程度的损伤；斑马鱼试验显示相对于氯硝硫胺（niclosamide，NIC），PRS对鱼类的致死浓度与杀螺浓度差别较大；哺乳动物急性经口毒性试验、眼刺激实验、急性皮肤刺激试验结果显示PRS对哺乳动物无毒性。2.不同浓度的PRS及对照药物吡喹酮（praziquantel，PZQ）对日本血吸虫虫卵作用24h后的孵化结果显示PRS对虫卵孵化的抑制效果略优于PZQ的作用，尤其是在4μg/ml浓度时，日本血吸虫虫卵对PRS的作用更敏感；PRS及对照药物PZQ在不同时间对毛蚴、尾蚴的作用结果显示其死亡率对PRS及PZQ的浓度及作用时间有一定的依赖性；在不同浓度PRS作用下日本血吸虫各个发育时期体外培养的结果显示药物对日本血吸虫的3h、7、14d童虫及42d成虫均有杀伤作用；日本血吸虫雄虫及雌虫经过30μg/ml PRS体外作用4h后虫体体表的感觉乳突及皮层均有一定程度的损坏；不同剂量PRS对不同感染时期的小鼠口服用药结果表明高、中、低剂量的PRS在体内均有一定的杀虫作用，但300mg/kg剂量的PRS有较好的疗效，感染1d和21d开始用药的杀虫及杀雌虫效果均优于相同剂量的青蒿琥酯（artesunate，ART）和PZQ；尾静脉注射25mg/kg剂量PRS的实验结果表明在日本血吸虫感染小鼠的不同阶段用药均有比较好的杀虫作用；25mg/kg剂量PRS作用24h后日本血吸虫雄虫、雌虫的糖原、蛋白、AKP、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽还原酶（glutathionereductase，GR）均有所降低。3.用150mg/kg/d剂量的PRS连续49d灌服感染50条尾蚴的C57BL/6小鼠发现，PRS治疗组小鼠体重的增加与感染不治疗组比较存在明显差异（P＜0.01），肝脾重量的降低与感染不治疗组比较存在明显差异（P＜0.01）；PRS治疗后小鼠白细胞的降低与感染不治疗组比较存在明显差异（P＜0.01），中性粒细胞、单核细胞及嗜酸性细胞比率的降低与感染不治疗组比较存在明显差异（P＜0.01），淋巴细胞和嗜碱性细胞比率的增多与感染不治疗组比较存在明显差异（P＜0.01）；PRS长期用药对感染50条尾蚴小鼠的荷虫量结果显示PRS用药组与感染不治疗组比较减虫效果存在明显差异（P＜0.01），减虫率为55.27%。肝脏虫卵的减少与不治疗组比较存在明显差异（P＜0.01）；用药49d后小鼠肝脏的苏木素伊红染色（hematoxylin andeosin staining，HE染色）显示PRS用药组肝脏的虫卵及卵周围炎性细胞相对于感染不治疗组较少；免疫组化显示PRS药物治疗后肝脏的α-平滑肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、金属蛋白酶抑制因子-1（tissue inhibitor ofmetalloproteinase1，TIMP-1）、转化生长因子-β1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ）及Ⅳ型胶原（collagen type Ⅳ）的表达与感染不治疗组比较明显减弱；PRS治疗组与感染不治疗组比较小鼠血清中的IFN-γ、IL-4、TGF-β和IL-17水平均有明显差异（P＜0.01）；PRS治疗组SEA特异性抗体IgG、IgG1水平与感染不治疗组相比明显降低（P＜0.01）；PRS治疗组与感染不治疗组相比SEA特异性抗体IgG2a水平变化不大（P＞0.05），PRS治疗组与感染不治疗组相比较IgG1/IgG2a比率降低。结论：1.实验数据显示PRS对哺乳动物几乎没有毒性，对斑马鱼毒性低于NIC，能够在较低浓度下有效杀死日本血吸虫中间宿主湖北钉螺，是一种非常有潜力的灭螺剂，2.体内外实验结果显示PRS对日本血吸虫各个发育阶段均有杀伤作用，有望成为新的抗血吸虫药物。3. PRS在治疗日本血吸虫感染宿主小鼠的过程中，小鼠血清中与免疫应答有关的细胞因子及特异性抗体发生了一定的改变，说明PRS的杀虫作用与皂苷的免疫调节有一定的关系。