siRNA干扰TMV侵染及其分子机理的研究

论文题目: siRNA干扰TMV侵染及其分子机理的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 赵明敏

导师: 安德荣,陈江野

关键词: 干扰,根癌农杆菌瞬时表达系统,烟草花叶病毒

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: RNA 干扰(RNA　interference,RNAi)是与内源性mRNA　编码区某段序列同源的双链RNA 导入细胞后,该mRNA　发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。被认为是植物在进化过程中发展出的一种非常古老的抵抗外来基因(病毒、转座子等)入侵的防御方式。21nt 的小干扰RNA(small　interfering　RNA,siRNA)作为RNAi 途径的重要中介,已被广泛应用于哺乳动物和人细胞体系中基因功能和抗病毒研究,但在植物抗病毒研究中应用较少。　根癌农杆菌介导的瞬时表达系统已广泛用于非转基因植物的基因功能研究,它不仅可以快速地导入外源基因,而且使转入基因在短时间内表达。它的另一个特点是可以在一个叶片组织中同时导入多个基因。由于上述优点,这一研究技术将在功能基因组学和蛋白组学研究中发挥更大的作用。　烟草花叶病毒(tobacco　mosaic　virus,TMV)是正单链RNA 病毒,是典型的模式植物病毒。研究清楚RNA 干扰在植物抗TMV 上的作用,可以带动其他病毒的相关理论问题和应用实践研究。因此,本文以烟草花叶病毒(tobacco　mosaic　virus,　TMV)基因组为靶位,设计合成表达小干扰RNA 的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121 中,直接转化根癌农杆菌EHA105。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了靶向TMV 复制酶基因(126kDa　蛋白)、外壳蛋白基因、和运动蛋白基因的siRNA 对TMV 侵染的干扰作用。实验得到以下结果:　1.　成功构建了在植物体内表达靶向TMV 复制酶基因(126kDa　蛋白)、外壳蛋白基因、运动蛋白基因的siRNA 重组表达载体。　2.　瞬时表达靶向TMV 复制酶基因(126kDa　蛋白)的siRNA 能干扰TMV 侵染。接种病毒14d 后,所有pBI/siRNA1519-　和pBI121 空载体处理的烟草上部叶片出现了TMV 侵染的典型花叶症状,而83%的pBI/siRNA1519　和85%的pBI/siRNA2129 处理的烟草上部叶片无任何症状产生。Northern　杂交结果也表明siRNA1519　和siRNA2129 处理的叶片TMV　RNA 水平显著降低,或者未检测到RNA 积累。相反,pBI121　和　pBI/siRNA1519-　的处理有较丰富的RNA 积累。随机突变5 个碱基的处理和阴性对照一样不能够抵抗TMV 侵染。表达TMV 复制酶基因的siRNA 处理接种异源病毒(CMV)后也不能抵抗异源病毒侵染。这表明siRNA 介导的干扰作用具有序列特异性和时间、位点依赖性。　3.　瞬时表达靶向TMV 外壳蛋白基因的siRNA 能干扰TMV 侵染。含有重组表达载体

论文目录:

第一章 文献综述

1.1 烟草花叶病毒研究概况

1.1.1 烟草花叶病毒的发现

1.1.2 烟草花叶病毒的危害症状

1.1.3 烟草花叶病毒粒子形态

1.1.4 烟草花叶病毒的基因组结构

1.1.5 TMV 基因组编码蛋白的功能

1.1.6 烟草抗TMV 的基因工程策略

1.2 RNA 干扰技术研究进展

1.2.1 RNAi的发现

1.2.2 RNAi 作用机制模型

1.2.3 RNAi途径中的基因组分

1.2.5 RNAi 的作用特点

1.2.6 RNAi 技术与反义寡核苷酸技术比较

1.2.7 RNA 干扰在动物研究中的应用

1.2.8 RNAi的在植物研究中的应用

1.3 植物病毒编码的沉默抑制蛋白

1.3.1 植物病毒编码的辅助蛋白 HC-Pro

1.3.2 番茄丛矮病毒编码的P19 蛋白

1.3.3 黄瓜花叶病毒编码的2b 蛋白

1.4 本研究的目的及意义

第二章 植物双元重组表达载体构建

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 试验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 植物双元重组表达载体

2.2.2 双元载体pBI121 酶切线性化

2.2.3 siRNA 重组表达载体构建

2.2.4 转化根癌农杆菌EHA105 菌株

2.3 讨论

第三章 瞬时表达靶向TMV基因组的siRNA能干扰病毒侵染

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 试验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 瞬时表达靶向TMV126kDa 蛋白的siRNA 能干扰病毒侵染

3.2.2 瞬时表达靶向TMV 外壳蛋白的siRNA 干扰TMV 侵染

3.2.3 瞬时表达靶向TMV 运动蛋白的siRNA 干扰TMV 侵染

3.3 讨论

第四章 瞬时表达PVA 病毒编码的HC-Pro 抑制siRNA的干扰作用

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 试验方法

4.1.3 HC-Pro 表达对siRNA干扰的抑制作用检测

4.2 结果与分析

4.2.1 HC-Pro 基因的特异性扩增

4.2.2 系统寄主上瞬时表达HC-Pro 抑制siRNA的干扰作用

4.2.3 枯斑寄主上瞬时表达HC-Pro 抑制siRNA 的干扰作用

4.3 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

• [1].壳寡糖对烟草花叶病毒的诱导抗病作用和体外抑制作用[D]. 商文静.西北农林科技大学2006
• [2].赤霉菌侵染后小麦穗部表达蛋白的差示分析及钙网联蛋白基因的克隆研究[D]. 王云.南京农业大学2006
• [3].辣椒轻斑驳病毒的检测及其与烟草花叶病毒症状差异相关因子研究[D]. 王亚南.中国农业科学院2008
• [4].烟草花叶病毒弱毒疫苗的研制及其分子生物学[D]. 邵碧英.福建农林大学2001
• [5].几种抗病毒药剂对烟草花叶病毒的抑制作用及相关机理研究[D]. 李红霞.河北农业大学2010
• [6].交替氧化酶在植物与病原物互作中的作用[D]. 徐婷.浙江大学2012
• [7].烟草花叶病毒的修饰和调控及其与安托芬类似物的相互作用研究[D]. 高爽.南开大学2010
• [8].高沉默效率植物病毒双链RNA的抗病毒研究[D]. 孙兆楠.山东农业大学2012
• [9].烟草抗病毒基因工程研究[D]. 牛颜冰.浙江大学2003
• [10].番茄花叶病毒（ToMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）单克隆抗体制备及ToMV在烟草上致病分子机理研究[D]. 于翠.浙江大学2004

相关论文

• [1].植物抗病毒基因工程研究 Ⅰ黄瓜花叶病毒复制酶基因表达载体构建和遗传转化 Ⅱ导入病毒基因的转基因植物释放的风险评估[D]. 温瑞.浙江大学2001
• [2].烟草抗病毒基因工程研究[D]. 牛颜冰.浙江大学2003
• [3].香蕉乙烯受体cDNA的克隆与特异性表达及RNAi技术应用于鉴定植物基因功能的方法研究[D]. 冯斗.华南热带农业大学2003
• [4].番茄花叶病毒（ToMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）单克隆抗体制备及ToMV在烟草上致病分子机理研究[D]. 于翠.浙江大学2004
• [5].嘧肽霉素抗烟草花叶病毒（TMV）作用机制研究[D]. 朱春玉.沈阳农业大学2005
• [6].siRNA干扰ES细胞nanog基因及nanog基因真核表达载体的构建[D]. 庄淑珍.西北农林科技大学2005
• [7].RNA干扰技术用于哺乳动物细胞中报告基因、端粒酶相关基因的表达抑制研究[D]. 何国平.四川大学2005
• [8].用RNA干扰（RNAi）抗草鱼出血病病毒的初步研究[D]. 陈芸.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2005
• [9].RNA干扰在抑制病毒基因表达与复制中的作用研究[D]. 邬开朗.武汉大学2005
• [10].烟草中与RNA干扰抑制子HC-pro互作蛋白的鉴定[D]. 靳永胜.中国农业大学2005

标签：干扰论文;  根癌农杆菌瞬时表达系统论文;  烟草花叶病毒论文;