鸭群中REV感染的流行病学调查及囊膜糖蛋白基因的序列分析

论文摘要

网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis, RE）是指由网状内皮组织增生病病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）引起的鸡、鸭、火鸡和其它禽类包括急性网状细胞肿瘤形成、生长抑制综合症、淋巴组织和其他组织的慢性肿瘤形成的病理综合症。这种疾病虽然不一定直接导致禽的死亡,但它们能降低其对其它疾病的抵抗力,给养禽业带来巨大的经济损失。REV可感染众多鸟类,鸭是其常见的自然宿主,从鸭的肿瘤病料中可以分离出REV。REV代表株中有两株来源于鸭,即鸭脾坏死病毒（SNV）和鸭传染性贫血病毒（DIAV）。但在我国,除了疫苗污染外,还没有关于鸭群中REV自然感染状态的报道。本课题利用REV env基因的保守序列,用地高辛标记核酸探针。从山东省不同地区不同日龄鸭群中采集法氏囊、脾脏、肝脏样品,通过组织DNA直接点杂交,常规PCR、巢式PCR检测REV核酸,并用组织匀浆接种CEF,培养分离病毒,IFA检测,完成了鸭群中REV感染的流行病学调查。从不同地区nest-PCR阳性产物中随机选择克隆测序,做同源性和进化树分析,从核酸亲缘关系上推测鸭群中REV的来源。实验一REV核酸探针检测方法的建立以经典鸭源SNV株前病毒全基因组cDNA的感染性克隆质粒pB101 DNA为模板,用REV特异性引物扩增env基因片段。PCR产物经测序验证无误后,回收、纯化、定量,用地高辛标记,制备出地高辛标记的核酸探针。该探针能与感染REV的细胞、组织提取的DNA发生特异性杂交。核酸探针敏感性和特异性试验结果显示:该探针能检测到1pg特异性核酸,具有很高的灵敏度和特异性。该研究为REV的诊断和流行病学调查提供了良好的方法。实验二鸭群中REV感染的流行病学调查随机采集来自山东省不同地区97只鸭组织样品220份,以提取的组织DNA为模板进行特异性斑点杂交、PCR和nest-PCR检测。用nest-PCR从其中121份组织DNA中检出REV特异性核酸,阳性率为55%,这说明山东省已有相当部分的鸭群感染或感染过REV。这是国内首次对鸭群中REV感染状态的流行病学报道。对上述样品同时进行细胞培养分离病毒、点杂交和常规PCR检测,但均为阴性。这与从鸡体内很容易检测或分离到REV显著不同,说明REV在感染鸭体内病毒含量很低,或前病毒DNA与鸭基因组发生整合的机率比鸡低。本实验对肝脏、脾脏、法氏囊检出率的分析比较发现,法氏囊的检出率明显高于肝脏和脾脏,差异极显著（P<0.01）。因此,今后在检测鸭群的感染时,应加强对法氏囊的检测。实验三禽网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白基因的克隆及序列分析REV基因序列相对保守,无明显高变区,但囊膜糖蛋白基因（env）较REV其他结构基因如gag、pol较易发生变异,也是决定病毒抗原性的主要基因,因此我们选择env作为检测基因。通过三个地区样品REV env基因的序列分析发现,YN-1株、BZ-1株核酸序列与美国分离的经典鸭源SNV株同源性最高,LQ-1株与美国鸡源分离株同源性最高,而均与中国鸡源REV分离株的同源性相对较低。进化树分析也表明YN-1株、BZ-1株与经典鸭源SNV株处于同一分支,具有较近的亲缘关系;LQ-1株与FA株具有较近的亲缘关系;三者与国内分离的鸡源REV毒株亲缘关系较远。由此推断,我国鸭源REV很可能是在引进未经对REV检疫的种鸭时引入的。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 一、禽网状内皮组织增生症综述
• 1. 病原学
• 2. REV 的生活周期
• 3. 流行病学
• 4. 病毒的传播
• 5. 症状及病理变化
• 6. REV 的致病病理与免疫
• 7. REV 引起的感染和免疫抑制
• 8. REV 感染的诊断
• 9. REV 预防和控制
• 二、本研究的目的及意义
• 实验一、REV 核酸探针的标记和敏感性、特异性检测
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 仪器和试剂
• 1.1.2 PCR 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 env 基因的克隆和序列测定
• 1.2.2 探针的标记
• 1.2.3 标记探针的敏感性检测
• 1.2.4 标记探针的特异性检测
• 2 结果
• 2.1 PCR 结果
• 2.2 PCR 产物的克隆和序列测定
• 2.3 核酸探针的敏感性试验结果
• 2.4 核酸探针的特异性试验结果
• 3 讨论
• 实验二、群中REV 感染的流行病学调查
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病料来源
• 1.1.2 检测试剂
• 1.2 病毒的分离
• 1.2.1 CEF 的制备
• 1.2.2 病毒的分离
• 1.2.3 IFA检测
• 1.3 组织 DNA 的提取
• 1.4 REV 囊膜糖蛋白基因序列的 PCR 扩增
• 1.4.1 PCR 扩增引物的设计和合成
• 1.4.2 PCR 扩增体系
• 1.4.3 PCR 反应条件
• 1.4.4 nest-PCR 反应
• 1.4.5 琼脂糖凝胶电泳
• 1.5 核酸杂交
• 2. 结果
• 2.1 样品中传染性REV 的检测
• 2.2 组织 DNA 直接斑点分子杂交
• 2.3 PCR 及nest-PCR 对 REV env 基因的检测结果
• 2.4 nest-PCR 产物特异性验证
• 2.5 不同器官与地区来源样品检出率比较
• 3. 讨论
• 实验三、禽网状内皮组织增殖症病毒囊膜糖蛋白基因的克隆及序列分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病料来源
• 1.1.2 分子生物学试剂
• 1.2 PCR用模板的制备
• 1.3 引物设计与合成
• 1.4 nest-PCR 扩增env 基因片段
• 1.5 目的片段PCR产物DNA电泳
• 1.6 PCR 产物的回收与定量
• 1.7 DNA 的连接反应
• 1.8 TG1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.9 连接产物的转化
• 1.10 质粒 DNA 的提取
• 1.11 重组质粒 DNA 的酶切鉴定
• 1.12 阳性克隆序列测定与比较分析
• 2. 结果
• 2.1 env 基因nest-PCR 扩增结果
• 2.2 阳性克隆双酶切结果
• 2.3 env 基因片段的测序结果与比较分析
• 2.3.1 env 基因片段的测序结果
• 2.3.2 nest-PCR 后序列比较结果
• 2.3.3 env 基因片段同源性比较
• 2.3.4 env 基因片段进化树分析
• 3. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 硕士期间发表论文
• 致谢