内脏脂肪素在动脉粥样硬化中的作用及机制研究

论文摘要

第一章血浆内脏脂肪素水平与动脉粥样硬化的相关性研究目的:通过测定不同动脉粥样硬化程度受试者的血浆visfatin水平与内皮功能状态,探讨在动脉粥样硬化患者中血浆visfatin水平与血管内皮功能紊乱之间关系,评估血浆visfatin水平在预测动脉粥样硬化发生发展中的意义。方法:同时接受冠脉造影和超声检测颈总动脉、肱动脉的215例患者纳入本研究,包括55名接受PCI术的急性冠状动脉综合征（ACS）患者。采用冠脉造影及颈总动脉超声和颈总动脉IMT结果评估冠状动脉粥样硬化的严重程度,采用Gensini积分系统,将入选患者分为正常对照组、轻度动脉粥样硬化组、中度动脉粥样硬化组、重度动脉粥样硬化组。所有组患者检测血浆visfatin和血清ADMA水平并同时超声检测肱动脉FMD评估血管内皮功能。结果:（1）与正常对照组比较,动脉粥样硬化组血浆visfatin水平显著升高,且严重动脉粥样硬化组高于早期和中度动脉粥样硬化组。（2）采用线性回归统计学方法证实,血浆visfatin水平与颈总动脉IMT呈正相关（r=0.158;P<0.05）;血浆visfatin水平与冠脉Gensini积分的正相关（r=0.306;P<0.01）;血浆visfatin水平与ADMA水平呈显著正相关（r=0.323;P<0.01）,而与肱动脉FMD呈负相关（r=-0.243;P<0.01）。（3）急性冠状动脉综合征（ACS）患者接受PCI术后,血浆visfatin水平和血清AMDA水平显著降低（P<0.01）。结论:动脉粥样硬化患者血浆visfatin水平升高,并能反映血管内皮功能紊乱情况和动脉粥样硬化严重程度,提示血浆visfatin水平可能与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关,是一个新的心血管疾病预测因子。第二章内脏脂肪素对内皮细胞血管形成能力的影响及机制研究目的:内脏脂肪素（visfatin）是一种能够促进血管新生的新型脂肪细胞因子。血管内皮生长因子（VEGF）作为血管新生中非常关键的因子,在培养的内皮细胞,二甲基精氨酸一二甲胺水解酶2（DDAH2）能够上调VEGF的表达促进血管新生。本实验研究DDAH2在visfatin诱导的内皮细胞血管新生中的作用。方法:在培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）,不同浓度的重组visfatin（0.01 nM-3 nM）处理6-24 h。Tube形成实验和迁移实验评价内皮细胞血管新生能力;Real time PCR检测DDAH2和VEGFmRNA水平;HLPC（高效液相色普仪）测定细胞内ADMA水平;Griess法测定细胞内NO水平;ELISA试剂盒检测细胞内VEGF水平;Western blot测定Akt的磷酸化和DDAH2蛋白水平;hDDAH2siRNA沉默内皮细胞DDAH2的表达。结果:重组visfatin能呈浓度和时间依赖性增强内皮细胞血管形成和迁移能力;同时,visfatin能够上调DDAH2和VEGF的mRNA和蛋白水平。在DDAH2沉默的内皮细胞,visfatin促内皮细胞新生的作用也显著降低。Western blot结果显示,visfatin作用内皮细胞能诱导Akt磷酸化。预先使用PI3K的特异性抑制剂能抑制visfatin诱导的DDAH2和VEGF的表达上调。结论:我们的实验证明,visfatin能够促进内皮细胞血管新生,其机制与激活PI3K/Akt,上调DDAH-VEGF通路有关。第三章内脏脂肪素对内皮祖细胞衰老的影响目的:内脏脂肪素（Visfatin）是一种新的脂肪细胞因子。最近研究发现,visfatin通过调节SIRT1水平抗内皮细胞衰老。冠心病患者内皮祖细胞（EPCs）的衰老损伤其增殖、迁移能力和脉管的形成,同时导致循环中EPC数量的降低,提示EPCs衰老在动脉粥样硬化发生、发展中起着重要的作用。因此,本实验研究visfatin对EPCs衰老的影响。方法:密度梯度离心法分离人脐血和外周血的单个核细胞,利用EGM-2细胞培养基（含EPCs分化所需各种生长因子）进行培养,诱导单个核细胞贴壁向EPCs分化。流式细胞术测定早期EPCs干细胞分子标志CD34+、vWF;Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染鉴定正在分化的EPCs。不同浓度的重组visfatin（0.01nM-10nM）处理24h。Tube形成实验和迁移实验评价EPCs血管新生能力;Real time PCR检测SIRT1mRNA水平;Western blot测定SIRT1蛋白水平;端粒酶定量法检测端粒酶活性;β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测细胞β-半乳糖苷酶活性;使用荧光染料H2DCF检测细胞内氧自由基（ROS）的生成。结果:（1）0.1nM和1nM的visfatin能增加EPCs形成管腔样结构和促进EPCs迁移,10nM的visfatin组EPCs形成管腔样结构能力和迁移能力却显著降低（与1nM visfatin组比）。（2）0.1nM和1nMvisfatin组细胞端粒酶活性和SIRT1水平明显升高（和对照组比）,而3nM和10nM visfatin组细胞端粒酶活性和SIRT1水平明显降低（与1nM visfatin组比）。（3）0.1nM visfatin组细胞β-半乳糖苷酶活性明显降低（和对照组比）,而3nM和10nM visfatin组细胞β-半乳糖苷酶活性明显升高（与0.1nM visfatin组比）。（4）visfatin能浓度依赖地增加EPCs内ROS的水平,而预先使用DPI 300μM和Allopurinol100μM能显著抑制10nM visfatinm所致EPCs端粒酶活性、SIRT1mRNA表达的降低和β-半乳糖苷酶活性的升高（P<0.01）。结论:生理浓度visfatin能抑制EPCs的衰老,病理浓度抑制其衰老作用降低,其机制可能与激活ROS的水平,引起氧化应激降低SIRT1的表达水平有关。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一章 血浆内脏脂肪素水平与动脉粥样硬化的相关性研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 第二章 内在脂肪素对内皮细胞血管形成能力的影晌及机制研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 附图
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 第三章 内在脂肪素对内皮祖细胞衰老的影响
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 附图
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历
• 攻读学位期间发表的科研论文