论文摘要
一、研究背景和目的系统性硬皮病（SSc）是一种病因不明、发病机制尚不明确、涉及多因素的复杂性疾病,临床上主要以皮肤和内脏器官纤维化、血管异常病变和免疫系统异常为主要特点的自身免疫性结缔组织病。其中纤维化是系统性硬皮病发病过程中最突出的特点,也是严重影响病人生活质量、甚至危及病人生命的主要威胁。在以往的研究中,系统性硬皮病的发病机理主要涉及纤维化、血管病变、免疫系统异常、双胞胎研究、遗传、种族、嵌合体等多个方面,也涉及了基因芯片、蛋白芯片等技术在基因组范围内进行研究,但均未能成功的解释其发病机理。MircoRNAs （miRNAs）是存在于许多生物体内长约1825 nt的一类短序列、非编码、具调控功能的单链小分子RNA,几乎参与所有生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育,细胞增殖、分化与凋亡,物质代谢等。目前已经明确,miRNAs是通过与其靶mRNA分子的3′端非编码区（3′-UTR）互补结合,在翻译水平上特异性抑制基因表达,在许多疾病的发病中扮演着重要角色。mircoRNA芯片是近年来出现的发展比较成熟的高通量基因芯片技术,能在特定的时间点筛选出患者与正常人之间的差异microRNA表达情况,已在不少复杂性疾病的研究中得到了广泛的应用,特别是恶性肿瘤的研究中应用最为广泛。目前多个研究已经证实microRNA与肿瘤的发病、转移、复发以及银屑病、系统红斑狼疮、恶性黑素瘤等疾病的发病密切相关,并找到了疾病特异性microRNA,如miR-203是银屑病特异性microRNA,miR-140与骨肉瘤密切相关等。SSc作为一种复杂性自身免疫性疾病,与肿瘤、银屑病、系统红斑狼疮有类似的地方,因此,我们推测在其发病机制中很可能也有其发病相关的microRNA。本研究用microRNA芯片技术和生物信息学的方法,在国内外首次对系统性硬皮病患者皮损和正常人皮肤中的差异microRNA进行分析筛选,并对筛选结果进行初步的分析和预测,以期获得与系统性硬皮病发病关系密切相关或特异性的microRNA,为进一步研究microRNA在系统性硬皮病发病中的分子机制、发现新的诊断标记与治疗靶点提供重要参考。二、对象与方法将研究对象分为SSc组和对照组。SSc组的纳入标准为:符合美国风湿病学会关于系统性硬皮病的诊断标准、发病较早（<2年）且未经过长期系统激素治疗（激素应用<3个月）、有全身皮肤的硬化及肺纤维化的证据但临床症状不明显的患者,正常对照组为包皮环切患者的皮肤或良性皮肤痣切除术患者边缘的正常皮肤;分别切取足量皮肤,提取总RNA,分离microRNA并进行荧光标记;然后进行杂交、清洗,之后进行microRNA芯片扫描;扫描结果用LuxScan3.0图像分析软件和SAM2.1软件进行差异microRNA的分析筛选;Real-time PCR方法随机验证筛选出的差异表达microRNA,以确保芯片结果的可靠性。生物信息学分析过程:首先,建立重点靶基因筛选库;其次,在microRNA数据库中（TargetScan数据库）进行其靶基因（mRNA）的搜索获得其功能注释;第三,将搜索到的靶基因与重点靶基因筛选库的基因进行比对,挑选出功能上与细胞外基质（ECM）、纤维化、血管异常、免疫异常等相关以及存在于重点靶基因筛选库中的基因,作为重点靶基因;第四,登录NCBI网站,将重点靶基因与SSc输入NCBI进行检索,检索式:“SSc and重点靶基因”;然后阅读检索出的文献,分析其是否与SSc发病相关;如有多个（≧5个）由同一个miRNA调节的靶基因与SSc发病相关,那么就可以初步预测出该miRNA与SSc的发病相关;生物信息学方法查询出差异表达microRNA所调节的靶mRNA,PubMed上检索出目前已发表文献中与系统性硬皮病发病相关的靶mRNA,即可初步预测出该microRNA与系统性硬皮病的发病相关。三、结果1.我们首次从系统性硬皮病患者皮损中筛选出24个差异表达microRNA,其中9个microRNA表达上调, 15个microRNA表达下调;并随机抽取三个microRNA——hsa-let-7g, hsa-miR-206和hsa-miR-125b,用Real-time PCR的方法进行可靠性验证,验证结果与芯片分析结果一致,表明芯片结果可靠;2.通过生物信息学（www.gogene.org,目前该网站在维护中,不能打开,可以通过http://www.targetscan.org进行microRNA靶mRNA的查询）和文献分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）发现有6个差异表达的microRNA其调节的靶基因与SSc的发病相关,其中hsa-miR-206调控的584条靶基因中有7条与SSc发病密切相关;hsa-let-7g调控的819条靶基因中有24条与SSc发病密切相关;hsa-miR-133a调控的502条靶基因中有12条与SSc发病密切相关;hsa-miR-125b调控的604条靶基因中有8条与SSc发病密切相关;hsa-miR-140-5p调控的251条靶基因中有7条与SSc发病密切相关;hsa-miR-23b调控的480条靶基因中有14条与SSc发病密切相关。四、结论1.microRNA不仅参与了系统性硬皮病的发病过程,而且可能在系统性硬皮病的发病中扮演着重要的角色;2.hsa-miR-206等6个miRNA与SSc发病密切相关,并很可能在SSc的发病中起着较为重要的作用;3.microRNA的表达异常可能是SSc发生、发展以及演化的重要分子事件,特别是在该病的早期阶段,可能起着更为重要的作用;4.有意义的差异表达microRNA可能是系统性硬皮病潜在的诊断标记、治疗靶点或重要的致病因素,为进一步研究系统性硬皮病的分子机制提供重要参考。