论文摘要
内质网应激导致的未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）与包括肿瘤和糖尿病等多种重大疾病密切相关,靶向调节UPR是目前抗肿瘤和抗糖尿病药物发现的热点之一。IRE1/XBP1信号通路是UPR三条信号通路之一,参与细胞生长、血管生成、脂肪细胞分化、脂代谢和糖代谢等多个重要生物学过程,并且XBP1在多种肿瘤组织中高表达。本论文旨在以IRE1/XBP1信号通路为研究对象,建立高通量筛选模型,发现参与调控IRE1/XBP1通路的新化合物,并研究其生物活性与作用机制。我们建立了基于细胞水平的IRE1/XBP1信号通路高通量筛选模型,用于发现IRE1/XBP1信号通路的新型抑制剂。首先构建得到pCAX-F-XBP1△DBD-luciferase质粒,与pcDNA3.1质粒共转入人胚肾细胞,经抗性筛选获得多个稳定表达荧光素酶的单克隆。然后利用内质网应激诱导剂衣霉素（Tunicamycin,TM）考察单克隆对内质网应激反应的敏感性,确定6#单克隆用于后续研究。其次对细胞接种量、溶剂DMSO终浓度和TM的作用浓度与孵育时间等条件进行优化,最终确定高通量筛选模型条件,Z’因子达到0.62。最后对国家新药筛选中心包含5.6万个化合物的小分子化合物库进行筛选,结合RT-PCR验证XBP1的剪切状态,共发现9个潜在的IRE1/XBP1抑制剂,其中化合物2、43和46的IC50分别达到0.738μg/ml、0.125μg/ml和0 .805μg/ml。接着利用2-Deoxy glucose（2DG）模拟实体瘤低糖的内环境,评价了筛选得到的XBP1剪切抑制剂抑制肿瘤细胞生长的效应,发现化合物2和17能显著抑制肿瘤细胞生长,并且化合物2在人肺癌A549裸小鼠移植瘤模型上有显著的抗肿瘤效应,T/C（%）值达到39.18。在第一部分的研究中,我们发现具有多种生物活性的传统中药-黄连素（Berberine,BBR）能够抑制2DG诱导的XBP1剪切。进一步的研究显示,在多株肿瘤细胞株上BBR与2DG联用可显著抑制肿瘤细胞生长,但对正常细胞株WI-38没有这种增强抑制效应。而且BBR和TM联合使用没有增强抑制肿瘤细胞生长的效应。进一步的机制研究显示虽然两者联用能够激活AMPK,但使用无活性AMPKα1腺病毒干扰细胞内源AMPK的功能后,2DG和BBR联用的效果没有改变,表明2DG和BBR联用显著抑制肿瘤细胞生长的作用不依赖于AMPK激活。接着我们考查了2DG和BBR联用对UPR的影响。Western blot、荧光素酶报告基因以及RT-PCR等方法显示2DG单独处理会激活UPR,但BBR与2DG联合处理具有浓度梯度依赖的抑制UPR下游关键指示基因GRP78和CHOP的表达,表明BBR与2DG联用干扰或抑制了UPR。而且Western blot结果显示BBR与2DG联用,可以抑制2DG诱导的包括IRE1/XBP1、ATF6和PERK-eIF2-ATF4在内的UPR三条信号通路。但BBR并不抑制TM诱导的UPR信号通路。BBR对UPR抑制的选择性与对细胞生长抑制的选择性一致,提示UPR抑制可能是两者联用增强肿瘤细胞生长抑制的原因之一GRP78是内质网功能的核心调节者,GRP78高表达可以缓解内质网应激,促进细胞存活。本文采用过表达GRP78腺病毒方法考查了GRP78对2DG和BBR联用效应的贡献,结果显示过表达GRP78可以部分逆转2DG和BBR联用对肿瘤细胞死亡和生长的抑制效应,表明UPR中GRP78表达的下调在2DG和BBR联用的抗肿瘤活性增强效应中具有重要作用。通过以上工作,我们建立了靶向IRE1/XBP1途径的细胞水平高通量筛选模型,发现了多个参与调控IRE1/XBP1通路的结构新颖、生物活性较好的小分子化合物,为进一步发现靶向调节IRE1/XBP1的药物奠定坚实基础。同时我们还发现传统中药黄连素（BBR）与2DG联用具有更好的抗肿瘤活性,而且这一增强作用不依赖于AMPK激活,而与UPR被严重破坏相关,这为进一步开发以2DG与BBR为基础的抗肿瘤药物提供了新思路。
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