基于SFV复制子的重组杆状病毒的研究

论文摘要

杆状病毒载体是目前应用十分广泛的病毒载体之一,它被广泛的应用于基因治疗、基因功能研究、疫苗开发等领域。长期以来,由于其宿主特异性,这种高表达的载体仅限用于介导外源基因在其受纳昆虫细胞内表达,近年来的研究发现,杆状病毒可进入某些哺乳动物细胞,但进入细胞后并不发生复制和基因转录。因此在杆状病毒载体中引入可在哺乳动物细胞中作用的启动子如RSV,CMV等,可通过杆状病毒将外源基因转入哺乳动物细胞中进行表达。SFV复制子载体是基于Semliki森林病毒的真核表达载体,主要包括基于RNA的SFV复制子系统和基于DNA的SFV复制子系统,后者由于其更高的安全性和稳定性而被更广泛的采用。基于DNA的SFV复制子载体系统构建策略为将SFV的cDNA置于真核表达载体启动子下游（如人巨细胞病毒（CMV）的早期启动子/增强子）,用外源基因代替结构蛋白基因,一旦由强启动子驱动的甲病毒非结构蛋白编码的复制酶复合物合成,便可介导细胞浆内重组RNA的大量复制,从而导致外源基因编码的mRNAs的高水平表达（Hsu et al,2004）,同时,甲病毒复制子不仅具有自主复制功能,而且具有与完整甲病毒相同的诱导宿主细胞凋亡的特性,使被转染细胞在短时间内发生凋亡。有鉴于此,本研究对杆状病毒载体的设计进行了新的探索,构建了插入SFV复制子的重组杆状病毒载体,并利用模式基因对载体的特性进行了研究,主要研究内容如下:1重组杆状病毒的构建及体外表达酶切质粒pSCA1,回收包含CMV-IE、SFV复制子和26s亚启动子的大片段,插入pFastBac Dual上,用以替换杆状病毒的p10及ployhedrin（pPolh）启动子,获得载体质粒pFastBac-CMV/SFV。以EGFP为报告基因,插入到pFastBac-CMV/SFV载体上位于26S启动子下游的BamHI位点,得到转移质粒pFB-CMV/SFV-EGFP,转化DH10Bac大肠杆菌,通过蓝白斑菌落及抗性筛选,获得重组穿梭载体,提取其基因组并转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒Bac-CMV/SFV-EGFP。同时酶切质粒pc-EGFP,回收CMV-EGFP表达盒,插入到载体pFastBac1上,获得转移质粒pFastBac-CMV-EGFP,并通过相同途径获得用于对照的杆状病毒Bac-CMV-EGFP。通过接种不同哺乳动物细胞,比较了重组杆状病毒Bac-CMV/SFV-EGFP与Bac-CMV-EGFP的表达差异。发现插入SFV复制子的杆状病毒能够高效介导外源基因的转导和表达,并具有明显的细胞选择性。我们进一步对杆状病毒Bac-CMV/SFV-EGFP在哺乳动物细胞上的最适表达条件进行了探索,分析了接种温度、接种剂量、接种时间等条件对表达的影响。并分别通过DNA-ladder和Caspase-3活性检测两种手段验证了受重组杆状病毒Bac-CMV/SFV-EGFP转导的哺乳动物细胞能产生明显的凋亡现象。2修饰的重组杆状病毒的构建及其免疫原性的研究杆状病毒由于不能在哺乳动物细胞内复制,具有很高的生物安全性,因而还可以用来作为体内基因投送的载体。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此,为了消除杆状病毒的补体敏感性,在本研究中利用水疱性口膜炎病毒G蛋白修饰杆状病毒。我们在pFastBac-G载体VSV-G基因的尾端引入SV40的“尾巴”,并引入酶切位点供SFV复制子的插入,获得中间质粒pFastBac-G-SV40,酶切质粒pSCA-EGFP,插入到pFastBac-G-SV40,从而获得转移质粒pFB-G-CMV/SFV-EGFP,并通过相同途径获得用于修饰后的重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-EGFP。通过接种哺乳动物细胞发现修饰后的杆状病毒对转导条件的依赖性显著降低,对哺乳动物吸附及进入的能力有显著提高。将重组病毒肌肉注射免疫小鼠,试验结果表明,在首免后第三周,重组病毒Bac-G-CMV/SFV-EGFP免疫组ELISA抗体水平明显升高,加强免疫之后,Bac-G-CMV/SFV-EGFP免疫组ELISA平均抗体滴度达到1:1440,显著的高于其它免疫组。细胞免疫水平表现出与体液免疫水平相似的趋势,不管是体液免疫水平还是细胞免疫水平,Bac-G-CMV/SFV-EGFP免疫组表现出最佳的免疫效果,表明所构建的重组杆状病毒载体是一种具有良好发展前景的疫苗载体。3杆状病毒介导的表达HA基因的重组杆状病毒的构建以及免疫原性的研究为进一步验证所构建的重组杆状病毒载体在体内基因递送的效率,我们以禽流感病毒主要保护性抗原基因HA为目标基因,构建了重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-HA,通过间接免疫荧光法证实它在哺乳动物细胞上的表达。将重组病毒肌肉注射免疫小鼠,并以本室所构建的自杀性DNA疫苗pSCA-HA为对照。实验结果表明,在体液免疫方面,重组杆状病毒并没有表现出显著优势,两者差异并不显著,但在细胞免疫方面,杆状病毒组极大的促进了IFN-γ的转录与表达,在转录水平上,与核酸疫苗的差异达到10倍之多。这一结果进一步表明本研究所构建的杆状病毒表达载体可以在疫苗的开发和生产上进行深入的研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1.1 杆状病毒简介
• 1.2 昆虫杆状病毒表达载体系统简介
• 1.2.1 杆状病毒表达系统的构建策略
• 1.2.2 杆状病毒表达系统的应用
• 1.3 重组杆状病毒介导的哺乳动物细胞内的基因转移
• 1.3.1 哺乳动物启动子介导的外源基因的表达
• 1.3.2 重组杆状病毒侵入哺乳动物细胞的机制
• 1.3.3 重组杆状病毒对于哺乳动物细胞系的选择性
• 1.3.4 影响基因转移效率及表达效率的因素
• 1.3.5 重组杆状病毒作为哺乳动物体内基因投送载体
• 1.4 甲病毒复制子
• 1.4.1 基于甲病毒复制子RNA疫苗
• 1.4.2 "自主复制型"RNA疫苗增强免疫反应的作用机制
• 第二章 研究的目的和意义
• 第三章 材料与方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 毒株、细胞与菌种
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 主要药品
• 3.1.4 本研究中所用的寡核苷酸引物
• 3.1.5 主要培养基及其配制
• 3.1.6 缓冲液
• 3.1.7 实验动物
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
• 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
• 3.2.3 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 3.2.5 连接产物的转化
• 3.2.6 质粒的小量制备（改良的碱裂解法）
• 3.2.7 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 3.2.8 脂质体介导转化法（Lipfectin2000,Invitrogen Corp.）
• 3.2.9 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图
• 3.2.10 重组穿梭载体（Bacmid）的构建
• 3.2.11 重组穿梭载体（Bacmid）的提取
• 3.2.12 重组杆状病毒获得
• 3.2.13 重组杆状病毒转导哺乳动物细胞
• 3.2.14 间接免疫荧光试验（IFA）检测目的蛋白的体外表达
• 3.2.15 重组杆状病毒介导的细胞凋亡检测
• 3.2.16 ELISA方法的建立
• 3.2.17 小鼠脾淋巴细胞的分离
• 3.2.18 实时荧光定量PCR检测免疫小鼠脾细胞中的IFN-γ相对表水平
• 3.2.19 IFN-γ的定量检测（双抗体夹心ELISA）
• 3.2.20 统计学方法
• 第四章 结果与分析
• 4.1 重组杆状病毒Bac-CMV/SFV-EGFP和Bac-CMV-EGFP的构建
• 4.1.1 转移载体pFB-CMV/SFV-EGFP及pFB-CMV-EGFP构建
• 4.1.2 重组Bacmid的获得及鉴定
• 4.1.3 重组杆状病毒的获得
• 4.1.4 重组杆状病毒介导的外源基因EGFP在哺乳动物细胞中的表达
• 4.1.5 转导条件对外源基因表达的影响
• 4.1.6 由杆状病毒引起的受转导细胞的凋亡
• 4.2 VSV-G修饰的重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-EGFP的构建
• 4.2.1 VSV-G修饰的重组杆状病毒载体的构建
• 4.2.2 VSV-G修饰的重组杆状病毒的获得
• 4.2.3 重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-EGFP在哺乳动物细胞上的表达
• 4.2.4 VSV-G修饰的重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-EGFP的小鼠免疫试验
• 4.3 VSV-G修饰的重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-HA的构建
• 4.3.1 VSV-G修饰的重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-HA的获得
• 4.3.2 间接免疫荧光检测重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-HA中HA基因的表达
• 4.3.3 重组杆状病毒Bac-G-CMV/SFV-HA的小鼠免疫试验
• 第五章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 SFV复制子对杆状病毒载体的影响
• 5.1.2 影响杆状病毒转导哺乳动物细胞的因素
• 5.1.3 细胞凋亡与免疫反应
• 5.1.4 VSV-G对杆状病毒载体的修饰
• 5.1.5 重组杆状病毒诱导的免疫应答
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录