论文摘要
背景:食管癌是世界上导致肿瘤相关性死亡的第六位病因,其病理类型主要包括鳞癌和腺癌。我国食管癌死亡率居世界首位,主要为食管鳞癌,约占全部食管癌的95%左右。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）是缺氧诱导因子1的主要缺氧调节亚单位,广泛参与哺乳动物细胞缺氧诱导产生的转录活化,在肿瘤缺氧适应性反应及血管生成中起着重要作用。血管内皮钙粘着素（vascular endothelial cadherin, VE-cadherin/VE-cad）是血管内皮细胞表面特异的跨膜粘附蛋白。它介导了相邻内皮细胞之间的粘附连接,在保持血管的完整性,调节内皮细胞之间的通透性和细胞内的信号传导中发挥重要作用。近年来有学者发现在一些高度侵袭性肿瘤细胞中同样高表达VE-cad,且参与了肿瘤细胞的仿血管生成,即血管生成拟态。血管生成拟态（vasculogenic mimicry, VM）是一种与经典的肿瘤血管生成途径完全不同、不依赖机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式。VM缓解了肿瘤内缺血缺氧微环境,也与肿瘤侵袭、转移及患者预后密切相关。HIF-1α的过表达可能与恶性肿瘤的VM的形成有一定联系。VE-cad作为VM的重要调控分子能够影响肿瘤的血管生成,具有潜在的抗肿瘤效应。目的:1.探讨HIF-1α表达沉默对人食管鳞癌细胞Eca109体内生长及血管生成拟态形成的影响,进一步筛选出HIF-1α作用于VM形成的可能靶基因。2.利用微小RNA干扰技术沉默VE-cad,构建VE-cad表达稳定抑制的食管鳞癌Eca109、TE13细胞株,研究VE-cad对食管鳞癌细胞血管生成拟态形成、增殖及凋亡的影响,探讨可能的机制。方法:1.六周龄BALB/c裸鼠随机分为3组（每组10只）,常规培养3组不同细胞,A组为食管鳞癌细胞Eca109,B组为转染空质粒的食管鳞癌细胞Eca109（Eca109/Neo）,C组为稳定转染shRNA干扰HIF-1α食管鳞癌细胞Eca109/shRNA,收集3组不同的细胞,分别注射于3组裸鼠肩背部皮下,观察移植瘤出现的时间,定期测量裸鼠体重,瘤体大小,计算肿瘤体积,肿瘤体积=（长径×短径2）/2。28天后处死全部裸鼠,称取瘤体重量,计算抑瘤率,绘制肿瘤生长曲线;2.过碘酸雪夫氏反应（periodic acid schiff,PAS）和CD31双重染色观察移植瘤组织中是否存在血管生成拟态（VM）及各组分布差异。免疫组化观察移植瘤组织中HIF-1α与上皮细胞激酶（EphA2）、血管上皮钙黏附素（VE-cad）、基质金属蛋白酶-2（MMP2）在肿瘤组织中的蛋白分布情况;RT-PCR和Western blot法检测移植瘤组织中HIF-1α与上皮细胞激酶（EphA2）、血管上皮钙黏附素（VE-cad）、基质金属蛋白酶-2（MMP2）在肿瘤组织中的mRNA和蛋白表达。3.将已构建并筛选出的pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiVE-cad质粒稳定转染食管鳞癌细胞Eca109和TE13,加入适当浓度的Blasticidin筛选,挑选单克隆,倒置荧光显微镜观察单克隆绿色荧光蛋白的表达情况并用Western blot法鉴定单克隆VE-cad的表达。4.采用MTT法检测Eca109、Eca109/neo、Eca109/miVE-cad和TE13、TE13/Neo、TE13/miVE-cad细胞增殖能力的差异;流式细胞术检测各组细胞凋亡率,观察抑制VE-cad基因对细胞凋亡的影响;三维培养方法观察两组细胞干扰前后的管腔样结构数目即体外血管生成拟态形成的影响;RT-PCR及Western blot法检测各株细胞中VE-cad与HIF-1α、EphA2、层粘连蛋白（Laminin5γ2） mRNA及蛋白表达的关系。结果1.A、B组于细胞接种后5-7天成瘤;C组于7-10天成瘤。各组成瘤率为100%。C组成瘤延迟,生长速度减慢。四周后统一处死裸鼠,测得移植瘤的体积和重量比较,C组相比两对照组差异有统计学意义（P<0.05）,抑瘤率为48%。2.PAS-CD31双重染色后,在未转染组及空质粒组近边缘及坏死带附近可发现CD31染色阴性,PAS染色阳性的管道结构（VM）,其内可见到红细胞。干扰组个别组织切片中可见。C组VM结构密度较A、B组明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）,A、B组间无明显差异（P>0.05）。免疫组化示HIF-1α定位于胞核及胞浆,以胞核为主,主要集中于坏死区周围的肿瘤细胞中;VE-cad定位于胞质及胞膜;EphA2及MMP2定位于胞质。C组中未见HIF-1α蛋白阳性表达,EphA2和VE-cad蛋白表达阳性细胞数明显低于两对照组,而MMP2表达与对照组无明显差别。RT-PCR和Western blot示C组mRNA的相对表达量较两A、B组稍减少,HIF-1α蛋白表达完全沉默,EphA2和VE-cad的mRNA和蛋白相对表达量明显低于A、B组,而MMP2相对表达量较两对照组无明显下降。3.Eca109和TE13转染后经3μg/ml杀稻瘟菌素（Blasticidin）有效筛选后每组各挑出数个单克隆,逐个行倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况,挑选荧光蛋白表达率约100%的单克隆株行Western blot鉴定。结果显示Eca109的32号单克隆（后命名为Eca109/miVE-cad）及TE13的16号单克隆（后命名为TE13/miVE-cad）转染效率较高,VE-cad蛋白表达明显受抑。4.MTT实验发现稳定转染后细胞Eca109/miVE-cad和TE13/miVE-cad的增殖能力较空质粒及未转染组明显减弱;流式细胞仪分析表明两组细胞凋亡率较各对照组明显增多;三维培养发现Eca-109、TE13细胞于Matrigel胶上常规培养12h后均可形成典型的管网状结构,干扰组细胞的管腔样结构形成能力明显低于对照组;RT-PCR和Western blot显示VE-cad的mRNA和蛋白表达明显抑制,相应地,EphA2、LN5γ2的mRNA和蛋白表达也明显下降,而未转染组及空质粒组无明显差异。下调VE-cad表达后对HIF-1α表达无明显影响。结论1.抑制HIF-1α表达能够有效抑制食管鳞癌Eca109的体内生长,使成瘤时间延迟、生长速度减慢。2.食管鳞癌细胞Eca109在体内可形成VM结构,HIF-1α沉默能够抑制食管鳞癌细胞体内VM形成。VE-cad、EphA2均为HIF-1α调控食管鳞癌VM形成的下游基因。3.pcDNA?6.2-GW/EmGFPmiVE-cad质粒能有效沉默Eca-109、TE13细胞VE-cad的表达。VE-cad对食管鳞癌细胞增殖和凋亡有重要影响。4.Eca-109、TE13细胞体外均可形成VM结构。下调VE-cad能有效抑制肿瘤细胞体外VM形成。VE-cad可能通过调控EphA2、LN5γ2的表达进而影响食管鳞癌血管生成拟态形成,并可能为HIF-1α调控食管鳞癌的血管生成拟态的关键位点。