论文摘要
细胞的无限制增长和肿瘤血管的形成是肿瘤生长过程中的两个关键因素，如果抗肿瘤药物能够同时瞄准一个以上的目标，采取“多个靶点”方式攻击癌细胞，就可能获得更好的临床效果。凋亡素（apoptin）是一种来源于鸡贫血病病毒（chicken anemia virus，CAV）的小蛋白质（VP3），由121个氨基酸组成，分子量为13.6kDa，它能够特异性地诱导人转化细胞和肿瘤细胞的凋亡。一系列的研究结果已证实apoptin作为一种抗肿瘤制剂是安全有效的。血管内皮抑素（endostatin）是近年来发现的最有效血管生成抑制因子之一。Endostatin为胶原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，编码184个氨基酸，分子量为20kDa。在本研究中，我们构建了一种新的融合基因，命名为Append，其表达产物的结构为以柔性多肽—甘氨酸接头（Gly4Ser）3将apoptin与endostatin连接起来的融合蛋白；之后利用原核表达系统表达该融合蛋白并对其生物功能进行评价。我们针对内皮抑素cDNA序列设计引物，用反转录聚合酶链反应从人胎肝总RNA中钓取内皮抑素cDNA；根据apoptin基因序列设计引物，用聚合酶链反应从质粒pUC-Apoptin中扩增凋亡素基因；采用重叠引物延伸法，使凋亡素基因和内皮抑素基因通过一个（Gly4Ser）3的连接肽基因相连接，构成融合基因Append；将融合基因Append克隆入pGEM-T easy载体中，通过酶切、PCR及序列测定；将测序正确的Append融合基因分别克隆进3种原核表达载体pLLP-OmpA、pET-His和pET-DsbA中，并将鉴定正确的原核表达载体分别命名为：pLLP-OmpA-Append、pET-His-Append和pET-DsbA-Append；之后优化原核表达条件；采用镍琼脂糖亲和层析法对表达的蛋白进行纯化；纯化的蛋白进行SDS-PAGE及Western Blot检测，并进行活性测定。实验结果表明，采用重叠引物延伸法获得了融合基因Append，全长为960bp，与预期相符；共构建了3个重组原核表达质粒，经过优化原核表达条件确定pLLP-OmpA-Append最适于表达Append融合蛋白，可溶性蛋白的表达量为1.43mg/L，纯度为91.7％。纯化的Append融合蛋白进行SDS-PAGE，获得的目的蛋白大小与预期相符，约为33.6kDa，Western blot鉴定结果为阳性；活性测定结果表明Append融合蛋白在体外可以抑制脐静脉内皮细胞的增殖并可诱导人神经胶质瘤细胞凋亡，在体内可以抑制血管的新生。本研究成功地构建了融合基因Append，并实现了Append融合蛋白在大肠杆菌中的表达，为开发具有多靶点效应的肿瘤治疗药物奠定了基础。
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