扰动剪切流场的体外模拟及其对低密度脂蛋白在血管内皮下沉积的影响研究

论文摘要

近年来,对动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）发病机制的研究受到越来越多的关注。AS好发于大中动脉分叉处血管外侧壁和弯曲血管顶部的位置,这些部位剪切力大小相对较低,且血液流动呈现紊乱、扰动等特殊的不规则现象。作为血液与血管壁接触的界面,血管内皮将直接受到血液动力学的作用。流行病学研究已证实,血浆脂蛋白尤其是低密度脂蛋白（low density lipoprotein,LDL）水平增高,可促进AS斑块的发生;病理学的研究认为在AS病斑形成的初期,主要是LDL在内皮下基质的沉积。因此,血液动力学显然是LDL在AS好发部位聚集的重要因素之一。那么,正常生理状况下,LDL通过与LDL受体（LDL receptor,LDLR）的识别、结合进而内吞进入血管内皮细胞,然后与溶酶体结合并降解,何以此时会在动脉好发区域的内皮下沉积,从而引发后续的一系列病变,导致AS的形成?此时,摄入细胞内的LDL的降解情况又怎样?对于这些问题的研究尽管较多,但大部分是在层流或简单的低剪切流动条件下得出的观察结果,并不能很好的说明血管分叉或弯曲等位置复杂的血液动力学所引起的生物学效应。研究发现,血管内皮对LDL的摄入主要通过内皮细胞上受体介导的内吞作用或利用内皮通透性进行渗透。因此,本研究希望通过体外模拟的AS好发部位血液流动特征的扰动剪切流场,探讨在培养的血管内皮细胞中,对LDL的摄入、降解及沉积负有潜在作用的重要因素,如小窝蛋白（caveolin,CAV）和内皮一氧化氮合酶（endothelialnitricoxide synthase,NOS）、LDLR和溶酶体等的变化情况,增进对LDL在内皮下基质沉积的了解,为解释AS病变之所以好发于分叉血管外侧壁和弯曲血管顶部等位置提供一些新的实验证据。研究的具体内容主要包括了以下几个方面:①构建带垂直台阶的流动腔系统,采用软刻法制作聚二甲基硅氧烷（poly-dimethylsiloxane,PDMS）流动腔。利用流体力学原理,采用有限元分析方法分析通道内的流型和剪切力分布（所用建模软件为gambit2.0,分析软件为FLUENT5.5）,为在腔内台阶下形成扰动剪切流场提供理论依据和进行体外力学加载实验时所需的具体的实验参数。根据构建的通道尺寸及流体性质,选择入口流速v=2 cm·s-1,模拟人体内AS好发部位的剪切流场情况。②利用制作的流动腔,采用Real Time PCR、ELISA和免疫荧光等方法,研究CAV-1对扰动剪切流场的响应,包括其mRNA表达、蛋白表达及分布行为。发现在流场作用下该区域中CAV-1的分布向胞膜易位,使得血管内皮细胞与LDL间的相互作用增加;剪切流场作用初期CAV-1的mRNA和蛋白表达均降低,导致内皮的通透性增加。由此增加了动脉粥样硬化病变初期血液内LDL在内皮下的沉积。③检测经过扰动剪切流场作用后的细胞灌流液中NO的生成情况。eNOS的活性催化部位主要位于小窝膜上,并存在与CAV-1脚手架区相连接的序列,它是血管内环境稳定的重要调节因子。扰动剪切流场作用初期NO合成有所增加,有助于血管内皮通透性增大,而有利于LDL在内皮下基质的沉积;流场的长时间作用引起NO的合成显著减少,这可能是导致疾病发展中白细胞与血管内皮细胞粘附、血小板附着增加等情况的原因之一。④利用构建的流动腔,采用Real Time PCR和央心ELISA等方法,研究血管内皮细胞LDLR对扰动剪切流场的响应,包括其mRNA表达和蛋白表达。发现血管内皮细胞的LDLR表达急剧降低,这可能直接导致细胞从血浆中摄取并利用的LDL减少,血浆中LDL积聚,从而使更多的血浆LDL停滞在AS好发区域,增加了细胞内外LDL的浓度梯度和LDL的内皮通透性;由受体介导的LDL降解途径减弱,使得移出细胞的LDL减少,内皮下的LDL沉积量增大。即增加了AS病变初期血管内皮下LDL沉积的总量。⑤检测血管内皮细胞酸性磷酸酶（acid phosphatase,ACP）的活力。在正常情况下进入细胞内的LDL将受到胞内溶酶体的降解。因此,进一步考察扰动剪切流场作用后细胞中溶酶体标志酶一ACP的表达情况,发现内皮细胞ACP的活力随着扰动剪切流场的作用而降低,提示流场作用使溶酶体对内吞进入细胞的LDL的降解过程受阻,由此导致内皮下LDL的进一步堆积。⑥为了能进一步完善实验,实现细胞内特定蛋白在流场中的定位及其对流场实时响应的观察,本研究还进行了部分后续工作的研究,内容包括:1)按照与PDMS流动腔相同的加工方法,在微图型化硅模上制作PDMS微图型化印章。再利用微接触压印的方法实现PDMS流动腔底面上纤连蛋白的图型化,由于PDMS的疏水性不利于细胞的生长,因此细胞会选择性贴壁生长在纤连蛋白区域,从而实现内皮细胞的图型化,为解决不同位置细胞的识别问题,及进一步用于实验信息的整合奠定基础;2)对获赠的LDLR-EGFP质粒进行转化、提取、浓缩与纯化实验,然后在FuGENE 6脂质体试剂的介导下将LDLR-EGFP重组质粒转染了CRL-1730细胞,通过G418筛选获取了稳定的抗性细胞克隆CRL-1730/LDLR-EGFP。运用免疫荧光和Western Blotting法分别检测了细胞中融合蛋白的表达。为能实时研究扰动剪切流场对内皮细胞LDLR等的影响做了准备。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩写词表
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出与研究意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 动脉粥样硬化的病理过程
• 1.2.2 血流剪切力对动脉粥样硬化病程影响的研究进展
• 1.2.3 小窝及小窝蛋白的研究进展
• 1.2.4 低密度脂蛋白受体的研究进展
• 1.3 课题研究的目的和内容
• 1.3.1 课题研究的目的
• 1.3.2 课题研究的主要内容
• 2 聚二甲基硅氧烷流动腔的构建与数值模拟
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要材料
• 2.2.2 PDMS流动腔的制作
• 2.2.3 PDMS流动腔的数值模拟
• 2.3 结果
• 2.3.1 流动腔的加工
• 2.3.2 流动腔
• 2.3.3 数值模拟
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 3 扰动剪切流场对血管内皮细胞小窝蛋白-1的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 细胞培养与种植
• 3.2.4 细胞的扰动剪切加载实验
• 3.2.5 血管内皮细胞 CAV-1的Real Time PCR检测
• 3.2.6 血管内皮细胞 CAV-1的ELISA检测
• 3.2.7 血管内皮细胞 CAV-1的免疫荧光检测
• 3.2.8 实验数据的统计学分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 流动系统的校正
• 3.3.2 血管内皮细胞 CAV-1 mRNA的表达
• 3.3.3 血管内皮细胞 CAV-1蛋白的表达
• 3.3.4 血管内皮细胞 CAV-1的分布情况
• 3.4 讨论
• 3.4.1 Real Time PCR
• 3.4.2 扰动剪切流场对血管内皮细胞 CAV-1表达的影响
• 3.4.3 扰动剪切流场对血管内皮细胞 CAV-1分布的影响
• 3.5 结论
• 4 扰动剪切流场对血管内皮细胞合成NO水平的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 细胞培养与种植
• 4.2.4 细胞的扰动剪切加载实验
• 4.2.5 灌流液中NO的检测
• 4.2.6 实验数据的统计学分析
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 5 扰动剪切流场对血管内皮细胞低密度脂蛋白受体的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 主要材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 细胞培养与种植
• 5.2.4 细胞的扰动剪切加载实验
• 5.2.5 血管内皮细胞LDLR的Real Time PCR检测
• 5.2.6 血管内皮细胞LDLR的ELISA检测
• 5.2.7 实验数据的统计学分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 血管内皮细胞LDLR mRNA的表达
• 5.3.2 血管内皮细胞LDLR蛋自的表达
• 5.4 讨论
• 5.5 结论
• 6 扰动剪切流场对血管内皮细胞溶酶体酶的影响
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 主要材料
• 6.2.2 主要仪器
• 6.2.3 细胞培养与种植
• 6.2.4 细胞的扰动剪切加载实验
• 6.2.5 血管内皮细胞ACP的检测
• 6.2.6 实验数据的统计学分析
• 6.3 结果
• 6.4 讨论
• 6.5 结论
• 7 其他相关研究工作
• Ⅰ 流动腔底面内皮细胞的图型化研究
• Ⅱ LDLR-EGFP融合基因的转染
• 8 全文结论
• 8.1 主要结论
• 8.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录:作者在攻读博士学位期间科研及发表论文情况