鸭肿头败血症病毒XD株的鸭胚原代细胞培养特性及免疫电镜观察研究

论文摘要

鸭肿头败血症病毒(Duck Swollen Head Septicemia Virus，DSHSV)，隶属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，鸭肿头败血症病毒呈球形，大小约65～80nm，无囊膜，该病毒核酸类型为双链RNA，基因组大于19Kbp。该病2002年首次报道，主要以病鸭头部肿大，全身弥漫性出血为特征。本试验通过对鸭胚日龄，胰酶浓度和营养液小牛血清浓度的选择，经过反复试验，采用14日龄鸭胚，经0.125％胰酶消化15～20min，使用含15％小牛血清的营养液成功培养鸭胚肝细胞，采用20日龄鸭胚，经0.25％胰酶消化5～10min，使用含20％小牛血清的营养液成功培养鸭胚肾细胞。通过鸭肿头败血症病毒(DSHSV)在鸭胚成纤维细胞，鸭胚肝细胞，鸭胚肾细胞上的培养特性观察，发现鸭肿头败血症病毒在鸭胚成纤维细胞和鸭胚肾细胞上不生长，病毒首次接种于鸭胚肝细胞上，24h开始出现细胞病变效应(CPE)，48h细胞病变达一半以上，随着在鸭胚肝细胞上继续传代，能稳定的出现一致的细胞病变，同时病变时间开始提前，细胞在接毒后8h开始出现细胞病变效应，几乎所有的细胞都可见明显的细胞病变，主要表现为细胞界限变清晰，胞核肿胀，胞内颗粒增多，16h原肿胀且颗粒增多的细胞出现明显的脱落，并且漂浮在细胞培养液中，脱落细胞约占50％。由于周边细胞脱落，未脱落细胞占据原飘落细胞的位置，使得单个细胞体积变大，细胞间隙增宽，接种24h后原致密的单层肝细胞因为病变细胞脱落而产生大量的空斑，细胞脱落约75％。病毒液中悬浮大量散在的脱落细胞。经纯化的鸭肿头败血症毒添加弗氏佐剂后，制备兔抗鸭肿头败血症病毒血清，处理后的鸭肿头败血症肝细胞毒和该血清做免疫电镜观察，观察到大小约65～70nm的球形鸭肿头败血症病毒粒子，另外通过鸭胚肝细胞毒回归鸭胚，发现整个胚体及头部出血，呈“红胚”，喙严重变型。通过免疫电镜观察和鸭胚回归实验证明在鸭胚肝细胞上的细胞病变为鸭肿头败血症病毒引起。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鸭肿头败血症病研究概述
• 1.1.1 鸭肿头败血症病原特性
• 1.1.2 DSHS流行病学
• 1.1.3 DSHS临床症状
• 1.1.4 DSHS病理变化
• 1.1.5 DSHS诊断技术研究及防治措施
• 1.2 动物细胞培养概述
• 1.3 禽胚原代细胞在病毒培养中的应用
• 1.4 免疫电镜技术的应用
• 1.4.1 免疫电镜技术简史
• 1.4.2 免疫电镜技术在病毒诊断上的应用
• 1.5 目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂和溶液的配制
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 鸭胚接种
• 50)测定'>2.2.2 鸭胚毒鸭胚半数致死量(DELD₅₀)测定
• 2.2.3 鸭胚成纤维细胞制备
• 2.2.4 鸭胚肝细胞制备
• 2.2.5 鸭胚肾细胞制备
• 2.2.6 DSHSV在鸭胚原代细胞上的生长试验
• 2.2.7 细胞培养毒验证实验
• 3 试验结果
• 50测定结果'>3.1 鸭胚毒DELD₅₀测定结果
• 3.2 鸭胚成纤维细胞生长情况
• 3.3 鸭胚肝细胞生长情况
• 3.4 鸭胚肾细胞生长情况
• 3.5 鸭肿头败血症病毒在鸭胚成纤维细胞上培养特性
• 3.6 鸭肿头败血症病毒在鸭胚肝细胞上培养特性
• 3.7 鸭肿头败血症病毒在鸭胚肾细胞上培养特性
• 3.8 细胞培养毒验证实验
• 3.8.1 细胞毒鸭胚回归试验
• 50测定'>3.8.2 鸭胚肝细胞毒DELD₅₀测定
• 3.8.3 DSHSV-XD株纯化及病毒蛋白含量测定
• 3.8.4 兔抗DSHSV高免血清制备及免疫电镜观察
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文题目