论文摘要
随着人们生活水平的提高,血栓栓塞性疾病患者逐年增加,血栓性疾病严重危害着人类的生命健康。因而开发出高效、无副作用、价廉的新型溶栓制剂是一项紧迫而重要的工作。蛇毒纤溶酶专一性较好,体内半衰期长且热稳定性较强。目前对蛇毒纤溶酶的开发研究主要集中于蝮亚科蛇蛇毒中,国内外先后对蝮亚科中的五步蛇（Agkistrodom acutus）、蝮蛇（Agkistrodom halys Pallas）、竹叶青（Trimeresurus stejnegeri）、烙铁头（Trimeresurus mucrosquamatus）等多种蛇毒的纤溶活性组分进行过报道,而对白唇竹叶青蛇蛇毒纤溶酶的研究未见报道。因此本研究以我国产白唇竹叶青蛇毒为研究对象,对其性质进行了分析研究,并从中提取出一种无出血作用的纤溶活性组分,初步鉴定该组分为α金属蛋白酶,并对理化性质及部分生物功能进行探讨,主要研究工作包括以下几个方面:1.测定白唇竹叶青蛇蛇毒的多种理化性质和生物活性,结果表明:白唇竹叶青蛇毒对小白鼠的半致死量（LD50）为7mg/kg;Lowry法测得毒液中蛋白质含量达81 %,SDS-PAGE电泳呈现多条蛋白质条带;具有水解酪蛋白的活性,且其活性可被EDTA抑制,提示白唇竹叶青蛇毒中含有金属蛋白酶;通过纤维蛋白平板法检测到毒液具有纤溶活性;具有精氨酸酯酶活性,检测到该蛇毒具有类凝血酶活性;该蛇毒的其他性质,如磷脂酶A2活性、5’核甘酸酶活性、碱性磷酸单酯酶活性、磷酸二酯酶活性。2.用DEAE-SephadexA-25, SephadexG-100和CM-SephadexC-50三步色谱法进行分离纯化,从白唇竹叶青蛇毒中分离纯化出分子量为66.3KDa的金属蛋白酶。SDS-PAGE电泳结果显示在还原性和非还原性条件下均为单一条带,表明白唇竹叶青蛇毒纤溶组分是由单一肽链组成的蛋白分子。以酪蛋白为底物测得其蛋白质水解酶比活力为0.68U/mg。酶的最适作用温度为40℃,最适PH为7;抑制剂EDTA,EGTA,对酶活力有明显的抑制作用,而PMSF（丝氨酸蛋白酶抑制剂）、β-巯基乙醇对酶活力没有影响;Cu2+对酶活力有明显的抑制作用,Zn2+对其活性有一定的增强作用;未检测到精氨酸酯酶活性存在;纤维蛋白原原降解实验显示,该组分与纤维蛋白原于37℃孵育5分钟便能迅速水解纤维蛋白原或纤维蛋白Aα链,随后缓慢水解Bβ链,而对γ链无作用,提示该组分可能为一种α金属蛋白酶;出血活性实验中,小鼠未出现皮下出现斑点,显示其无不含出血毒活性。结论:我们首次从我国产的白唇竹叶青蛇（T. albolabris）毒中分离纯化得到一种新的蛇毒纤溶酶,该酶纤溶活性强能同时水解纤维蛋白原Aα链和Bβ链,且无出血作用。但有关该组分的分子结构、活性中心以及分子溶纤机制尚待进一步探讨,为进一步基因克隆与表达以及临床应用研究提供理论基础,以达到制备具有实际应用价值的蛇毒酶溶栓制剂的目的。