论文摘要
目的：研究慢病毒载体介导的特异性S期激酶相关蛋白2（Skp2）RNA干扰对人子宫内膜癌HEC-1-A细胞在裸鼠体内生长的影响，并探讨其在子宫内膜癌发生发展中的可能作用机制，为子宫内膜癌的基因治疗提供新的靶点及实验依据。方法：应用RNA干扰（RNAi）技术，将课题组前期成功构建的针对Skp2基因的重组慢病毒表达载体LV-Skp2-shRNA及阴性对照空载体LV-Skp2-NC分别体外转染人子宫内膜癌HEC-1-A细胞。倒置荧光显微镜结合流式细胞仪检测和分选出转染成功的细胞扩大培养。将HEC-1-A组细胞、 LV-Skp2-NC组（LV-Skp2-NC/HEC-1-A）细胞、LV-Skp2-shRNA组（LV-Skp2-shRNA/HEC-1-A）细胞分别接种于裸鼠皮下，建立裸鼠皮下移植瘤模型。每天观察裸鼠一般情况及皮下移植瘤的生长，每4天测量皮下移植瘤长短径计算瘤体体积并绘制移植瘤生长曲线；4周后断颈处死裸鼠，计算皮下移植瘤的体积、瘤重，计算肿瘤生长抑制率；苏木素-伊红染色（HE染色）观察移植瘤组织病理形态学变化；半定量RT-PCR法和Western blot法分别检测移植瘤组织中Skp2、p27的mRNA和蛋白表达变化。结果：1.将LV-Skp2-NC、LV-Skp2-shRNA体外转染HEC-1-A细胞，转染效率70%左右，经流式细胞仪分选后所得细胞转染比例达90%以上，传代后转染率无明显下降。2.移植瘤生长曲线显示，与HEC-1-A组、 LV-Skp2-NC组相比，LV-Skp2-shRNA组裸鼠皮下移植瘤成瘤潜伏期延长且生长缓慢，瘤体体积及重量均明显减小，差异有统计学意义（P<0.05），肿瘤生长抑制率为77.4±4.8%。3.HE染色结果显示，HEC-1-A组、LV-Skp2-NC组肿瘤组织细胞异型性明显，细胞密集不规则，细胞核深染，病理性核分裂多，肌层浸润明显，侵袭能力强。4.半定量RT-PCR及Western blot结果表明，LV-Skp2-shRNA组与其它两组相比，移植瘤组织中Skp2的mRNA和蛋白表达均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），抑制率分别为70±1.3%、65.1±1.7%；p27在mRNA水平无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05），而在蛋白水平表达显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），增长率为（61.9±0.4%）。结论：应用慢病毒载体介导的RNAi技术，靶向沉默人子宫内膜癌HEC-1-A细胞中Skp2基因的表达，能够明显抑制其裸鼠皮下移植瘤的生长。移植瘤组织中Skp2、p27mRNA及蛋白的表达情况表明，高表达的Skp2可能在转录后水平通过泛素化降解p27蛋白的途径而促进人子宫内膜癌的发生发展，与前期体外实验的结论一致。本研究表明RNAi技术是研究特定基因功能及基因治疗的新型方法，Skp2-p27通路有望成为人子宫内膜癌基因治疗中新的切入点。